酵母铬对热应激绵羊肝脏组织基因表达的影响

杨改青 杨斯涵 梁本聪 王林枫* 付 彤 廉红霞 张立阳 高腾云

（1．河南农业大学实验室与设备管理办公室，河南 郑州 450046；2．河南农业大学动物科技学院，河南 郑州 450046）

铬是人和动物机体所必需的一种常见的微量元素，在调节内分泌、提高生产性能和胴体品质、增强动物的免疫反应、改善糖和矿物质代谢等方面具有一定的积极的作用[1]。三价铬包括无机铬（氧化铬、氯化铬）和有机铬（蛋氨酸铬、毗陡甲酸铬、烟酸铬和酵母铬）[2]。酵母富含蛋白质、核酸、糖原、生物素、B 族维生素、胆固醇等多种活性物质，营养价值高[3]。酵母铬是以酵母菌作为载体，通过一定的工艺与无机铬培养基进行培养，通过生物转化的方式将无机铬同化在有机生物大分子上，进而转化生物活性、吸收率低的无机铬，使其更易被动物吸收的一类物质[4]。酵母铬在参与畜禽营养代谢[5]、缓解动物应激反应、提高机体免疫力、降低脂肪沉积、增加不饱和脂肪酸含量[6]、改善繁殖性能[7]、提高胴体品质[8]、提高生产性能[9]等方面均具有一定作用。热应激会影响畜体的抗氧化酶活性，使畜体产生免疫应答[10]。酵母铬还可以增强胰岛素与特定的受体和组织的结合，增强胰岛素在蛋白质代谢、能量代谢、脂肪代谢、脂肪沉积和胆固醇中的作用[11]，通过调节体内的酸碱平衡达到提高畜体免疫力的目的。目前，有关酵母铬对畜体作用的研究多集中于细胞的生长和繁殖，对肝脏作用的报道则较少。肝脏作为储存活性铬的器官，对畜体的铬含量很敏感，因此需要探讨日粮中酵母铬对动物肝脏代谢、热应激和免疫相关基因的表达的影响。本试验对转录组测序数据进行初步的挖掘，为进一步揭示生物合成路径及调控机制、关键酶基因功能研究等提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲养管理

试验于2018年7月8日—8月26日，在河南省洛阳龙须坡农牧有限公司养殖基地进行。预试期5 d，正式试验期45 d。选择5～6 月龄，体重相近、健康状况良好的“杜×湖”杂交（杜泊公羊与湖羊母羊交配）绵羊14只，随机分为对照组（基础日粮，CTL组）、酵母铬组（基础日粮+0.5 mg/kg 酵母铬，Cr 组），每组7 个重复，每个重复1 只羊。酵母铬由河南某有限公司提供，铬含量0.002 25%，蛋白质含量47.6%，水分含量4.2%，粗灰分含量6.4%。参照NRC（2007）[12]饲养标准配制日粮，基础日粮组成及营养水平见表1。

表1 基础日粮组成及营养水平（干物质基础）

对圈舍进行统一打扫并进行消毒，羊进行统一驱虫，试验期间测定圈舍内温湿度[7]。各组羊分圈饲喂，每天7：00、16：30各饲喂一次。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 热应激的判断与评价

热应激程度用温湿度指数（THI）衡量。

式中：T为温度（℃）；RH为相对湿度（%）。

1.2.2 生长性能

预饲期连续3 d对空腹状态的羊进行称重，试验结束再次进行称重，计算每只羊的平均日增重、平均日采食量、料重比。

1.2.3 屠宰性能

饲养试验结束后，试验动物24 h 禁食，12 h 禁水，称重后进行屠宰，计算胴体重、屠宰率等屠宰指标。

1.3 肝脏组织转录组

1.3.1 组织样品采集

屠宰后，从每组选取4 个样品用作转录组测序的绵羊肝脏组织样品，于-80 ℃冰箱中冷冻保存，用于RNA的提取。

1.3.2 测序样品的RNA提取、文库构建及文库检测

提取肝脏组织样品的RNA，通过Nanodrop检测RNA纯度（OD260/280nm、OD260/230nm），通过Agilent 2100对RNA片段长度进行检测。文库质检合格后，按照根据文库有效浓度及测序读长进行测序。RNA-Seq 文库构建和测序利用Illumina二代高通量测序平台进行测序。

1.3.3 数据过滤、组装及差异表达分析

为保证数据分析的质量，需要过滤去除2 个样本的原始序列中包含的接头或者低质量序列。处理以后获得的高质量数据选择Tophat2软件进行参考基因的比对。基于Wallenius non-central超几何分布，采用GO seq软件进行GO（gene ontology）富集分析。以KEGG 数据库中Pathway为单位，应用超几何检验，找出与整个转录组背景相比，在差异表达基因中显著性富集的Pathway。

1.3.4 实时荧光定量PCR验证

提取6 个样品的总RNA，反转录为cDNA，根据SYBR Premix EX TaqTM试剂盒说明书进行荧光定量PCR 验证，以GAPDH为内参基因，实时荧光定量PCR 引物设计见表2。

表2 实时荧光定量PCR引物设计

采用2-△△Ct法计算各基因的表达量，对8个随机选择的差异基因进行实时荧光定量PCR验证，与RNA-Seq测序结果相比较，检测RNA-Seq测序数据是否可靠。挑选与热应激、免疫相关的3 个差异基因，通过RT-qPCR 检测基因的相对表达量。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用Excel 进行初步整理，SPSS 24.0 软件进行分析。结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 试验期间THI变化情况（见图1）

图1 试验期间THI变化情况

由图1 可知，整个试验过程中THI 均大于72（最低74，最高85），表明试验羊处于热应激状态。

2.2 酵母铬对绵羊生长性能的影响（见表3）

表3 酵母铬对绵羊生长性能的影响

由表3 可知，试验结束时，Cr 组绵羊末重较CTL 组增加了5.06%（P＞0.05）。Cr组绵羊平均日增重与CTL 组相比有所下降，但差异不显著（P＞0.05）。Cr组绵羊平均日采食量与CTL组相比有所增加（P＞0.05）。

2.3 酵母铬对绵羊屠宰性能的影响（见表4）

表4 酵母铬对绵羊屠宰性能的影响

由表4 可知，Cr 组绵羊宰前活重、大网膜重、肾周脂肪重、屠宰率与CTL 组之间均差异不显著（P＞0.05），Cr组胴体重显著高于CTL组（P＜0.05）。

2.4 肝脏组织测序数据过滤

测序产生的原始数据通常会带有少量接头污染及较低质量的读长片段，通过过滤原始数据从而得到干净的序列，以免对后续数据分析造成影响。8个样品的测序数据统计结果见表5。由表5 可知，Q20、Q30 含量均在90%以上，说明测序数据良好，可满足后续数据分析。

表5 8个样品的测序数据统计结果

2.5 肝脏组织差异表达基因筛选（见图2）

图2 差异基因火山图

显著性差异表达基因的筛选标准为log2倍性变化≥2和P＜0.05。由图2可知，试验共筛选出821个差异表达基因，340个基因表达量上调，481个基因表达量下调。

2.6 差异基因的GO分析（见图3）

图3 差异表达基因GO富集分析

按照GO 功能分类，将GO 注释分为3 大类，分别为生化过程、细胞组分和分子功能。由图3 可知，本试验结果主要集中在生化过程。

2.7 基因的KEGG功能分类

对差异基因进行KEGG 分析，前20 个显著富集的通路见图4。由图4可知，差异基因主要富集在系统性红斑狼疮、吞噬体等通路。

图4 差异表达基因KEGG富集分析

2.8 差异表达基因实时荧光定量PCR验证（见图5）

图5 差异表达基因的实时荧光定量PCR验证

通过对差异表达基因进行筛选、功能注释及富集分析后，从中筛选出8 个差异表达基因，分别是C4BPA、HSD17B6、GRIA1、ZEP42、KCNT2、TNFRSF9、TMED2、ELAVL2。以GAPDH为内参基因，对上述8个差异表达基因进行RNA-Seq验证。定量结果显示，差异表达基因的表达趋势与测序结果一致，表明转录组测序技术在筛选差异表达基因上较为可靠。

2.9 酵母铬对绵羊免疫、热应激相关因子基因表达的影响（见图6）

图6 差异基因的实时荧光定量PCR结果

由图6可知，与CTL组相比，Cr组CD80表达量有所增加，但差异不显著（P＞0.05）。Cr 组CD86 显著低于CTL组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 酵母铬对绵羊生长性能的影响

当动物产生应激时，机体会产生大量的葡萄糖代谢产物，以对抗应激；而血糖的升高会导致铬的动员量升高，被调动的铬无法再被吸收，随着尿排出体外，即给予高强度的铬可以提高动物的抗性[13]。Cr3+是葡萄糖耐受因子，在饲粮中加入铬复合物可使胰岛素与受体细胞膜结合，从而增强糖代谢通路的酶活力，减少糖异生通路的酶活力，提高机体对葡萄糖的吸收和利用；提高机体对胰岛素的敏感度，参与蛋白合成，促进肌肉生长，提高其生长能力[14]。本试验结果显示，与CTL 组相比，添加0.5 mg 的酵母铬对绵羊的增重无显著影响，是否与CTL添加剂量或添加方式相关还有待探究。

3.2 酵母铬对绵羊屠宰性能的影响

饲料补充方式、饲喂方式、绵羊的日龄、宰前活重、膘情等均是影响屠宰效果的重要因素，提高屠宰日龄、屠宰前活重对屠宰率有显著影响。脏器的重量是评价动物身体功能的一个重要指标[15]。本试验中，Cr 组绵羊胴体重显著高于CTL 组，表明酵母铬对绵羊生长具有一定促进作用；Cr组屠宰率与CTL组相比差异不大，可能是由于试验组内脏器官的重量较大，导致各组屠宰率无显著差异。

3.3 酵母铬对绵羊肝脏差异表达基因的影响

肝脏作为动物体的重要器官，动物的生长发育、物质代谢均与肝脏代谢途径相关[16]。动物产生应激后体温调节能力会遭到破坏，机体的免疫力下降[17]，肝脏作为新陈代谢的器官，其解毒能力也会存在下降情况[18]。

RNA-Seq 也被称为转录组测序，是近年来逐步发展的新一代转录分析技术。本试验以绵羊肝脏组织为研究对象进行转录组测序分析，获得原始测序数据在8 000万以上，序列比对率均在80%以上，且Q30也在90%以上，碱基识别准确率高。以log2倍性变化≥2 和P＜0.05 为标准，筛选出包括340个上调和481个下调表达的基因。通过对差异表达基因进行筛选、功能注释及富集分析，选取8 个差异表达基因进行实时荧光定量PCR 验证，结果与RNA-Seq结果趋势一致，表明了转录组测序技术在差异表达基因方面的准确性及可靠性。

免疫球蛋白超家族成员CD80、CD86 作为T 淋巴细胞中重要的共刺激分子，在抗原递呈细胞（APC）表面表达，与相应配体进行结合并诱导T 淋巴细胞发挥其功能。细胞因子IL-4、IL-12、LPS等对CD80、CD86的表达起一定的调节作用[19]。CD80 在接受抗原刺激2～3 d 后表达量上调，而CD86在接受刺激之后可迅速上调[20]。细胞因子的分泌主要是通过与免疫细胞表面的相应受体与CD80、CD86 结合，进行调节发挥相应的作用[21]。本试验中，Cr 组CD80 在肝脏中表达量上调，肝脏作为补体合成的重要器官，这可能是机体自身的一种保护机制，对肝脏起到一定的保护作用。CD80、CD86 可对以T 淋巴细胞免疫为主的自身免疫性疾病起到一定的调节作用；本研究结果表明，酵母铬能够通过促进CD80、抑制CD86 进而对T 细胞产生调节作用[22]。HSP70 是热休克蛋白中的一类应急表达的分子伴侣蛋白[23]。HSPA1A不仅是HAP70 家族中的一类诱导型表达基因[24]，也是目前HSP70 家族中研究最多的一种热休克蛋白[25]。HSPA1A是热休克蛋白中最为保守的一种，在各种应激条件下均会大量表达[26]。本试验中，与CTL 组相比，Cr 组肝脏组织的HSPA1AmRNA表达量有所增加，表明Cr可提高动物对热应激的适应能力。

4 结论

本试验结果表明，日粮中添加适量酵母铬可改善绵羊的屠宰性能。酵母铬通过上调CD80，抑制CD86 进而对T 细胞产生免疫调节作用，能够提高机体对热应激的适应能力，保护绵羊肝脏免受损伤。