竹节参总皂苷通过减轻成纤维细胞生长因子21 抵抗改善自然衰老大鼠的认知功能障碍

岳博文，倪露，郑莹，胡凡馨，杨啟巧，袁成福，袁丁，王金娥，周志勇（国家中医药管理局中药药理三级实验室，三峡大学医学院，湖北 宜昌 443002）

衰老是神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）及亨廷顿病（HD）等发生发展的最大风险因素[1]，几乎所有老化的大脑都表现出与神经退行性疾病相关的特征性变化。衰老与认知功能障碍密切相关，研究发现衰老大鼠的海马CA1 区突触后密度减小、海马CA3 区突触素降低，空间学习能力明显下降[2]；衰老恒河猴在长时间的记忆间隔实验中表现出学习缺陷和显著的记忆障碍[3]。研究[4]表明，成纤维细胞生长因子21（FGF21）在中枢神经系统损伤修复中具有重要作用，给予外源性FGF21 可以缓解APP/PS1 转基因AD 小鼠的记忆功能障碍，FGF21 还可以通过PP2A/MAPKs/HIF-1α 通路保护AD 样病变处的神经元。竹节参总皂苷是中药竹节参的主要活性成分，具有抗炎、延缓衰老等多种药理作用[5]。本课题组前期研究[6]发现，竹节参总皂苷对衰老大鼠的神经炎症具有较好的改善作用。因此，本研究拟继续探讨竹节参总皂苷对自然衰老大鼠认知功能障碍的改善作用，并从FGF21 抵抗角度探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 50 只SPF 级雄性SD 大鼠，购自湖北省宜昌市三峡大学实验动物中心，包括10 只5 月龄大鼠［体质量（510.67±37.24）g］及40 只18 月龄大鼠［体质量（756.83±35.72）g］，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2017-0012。本实验获得三峡大学实验动物伦理委员会批准，动物伦理审批号：2017030。

1.2 药物及试剂 竹节参总皂苷（提取率为18.4%，纯度为83.5%），由本课题组制备[7]。亚精胺，美国Sigma 公司，批号：BCBW6017；β-actin 兔多克隆抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GB11001； FGF21 兔抗体（批号：A3908）、β-klotho兔抗体（批号：A15629），均购自武汉爱博泰克生物科技公司；FGFR1 兔抗体，美国Cell Signaling 公司，批号：#9740；P-ERK 小鼠单克隆抗体（批号：sc-7383）、ERK 小鼠单克隆抗体（批号：sc-94），均购自美国Santa Cruz 公司；RIPA 裂解液（批号：2022R0FC1053）、BCA 蛋白浓度定量试剂盒（批号：P1511），均购自北京普利莱基因技术有限公司。

1.3 主要仪器 XR-XM101 型Morris 水迷宫，上海欣软信息科技有限公司；TYPE1500-458 型全波长酶标仪，美国Thermo Electron 公司；H-7500 型透射电子显微镜，日本HITACHI 公司； PowerPas Basic 200型电泳仪，美国Bio-Rad 公司；Bioshin ChemiQ 4800 型化学发光成像显影仪，上海欧翔科学仪器有限公司；TP1020 型自动脱水机、EG1150C 型超薄切片机，德国Leica 公司。

1.4 分组、给药及样本采集、处理 将40 只18 月龄SD 雄性大鼠随机分为模型组（10 只）、竹节参总皂苷低剂量组（10 mg·kg-1，10 只）、竹节参总皂苷高剂量组（30 mg·kg-1，10 只）、亚精胺组（1 mmol·L-1，10 只），另取10 只5 月龄雄性SD 大鼠作为对照组。模型组及对照组大鼠给予正常维持饲料；竹节参总皂苷低、高剂量组大鼠分别给予含有药物的混合饲料（按18 月龄大鼠每只每日进食量为5 g 计算，最终给药剂量为10、30 mg·kg-1）；亚精胺组大鼠给予正常维持饲料，同时自由饮用含亚精胺的饮用水（浓度为1 mmol·L-1）；以上各组大鼠连续饲养4 个月。

给药结束后，大鼠禁食不禁水12 h，按照5 mL·kg-1的剂量腹腔注射20%乌拉坦溶液对大鼠进行麻醉；麻醉后腹主动脉取血，然后进行心脏灌流：打开胸腔暴露心脏，从左心室进针至主动脉，用动脉夹固定，剪开右心耳，生理盐水冲洗20 min，待肝脏变白后，换成4%多聚甲醛溶液继续灌注30 min。灌注结束后，快速断头取脑，部分大鼠分离出脑皮层及海马组织，液氮中快速冷冻，样本保存于-80 ℃冰箱备用；部分大鼠将整个脑组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中备用。

1.5 Morris 水迷宫实验 实验前1 d 将水注入直径为100 cm、高度为45 cm 的水池中，于某一象限中间位置放入平台，使水面高于平台2 cm，并画出平台位置；提前将水温加热至15～25 ℃，并在实验过程中保持水温；实验开始前2 h 将大鼠移至操作间，使之适应实验环境。前5 d 为适应性训练，记录大鼠找到平台的潜伏期。第6 天撤走平台，选择平台所在象限的对角象限边缘中间位置为入水点，捕捉大鼠在60 s 内的行为轨迹。

1.6 HE 染色法检测皮层及海马神经元的病理变化灌注后将大鼠整个脑组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片；HE 染色后脱水，用中性树胶封片，在光学显微镜下观察皮层及海马部位神经元的病理变化。

1.7 Nissl 染色法检测皮层及海马神经元尼氏体的变化 灌注后的大鼠脑组织用4%多聚甲醛溶液固定24 h 后，用75%乙醇再浸泡24 h；然后经过脱水、浸蜡后包埋、切片、摊片、烤片等步骤即得实验用切片，切片厚度为4 μm。大鼠脑组织切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，擦干载玻片上多余的水，滴加Nissl 染液，37 ℃下浸染10 min；双蒸水冲洗，95%乙醇分化10 s，擦干多余的乙醇；二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察大鼠皮层及海马部位神经元数量的变化。

1.8 透射电镜检测皮层线粒体超微结构的变化 取灌注后的大鼠脑组织皮层部位0.5～1 mm3的小块，组织块先用2.5%戊二醛溶液在4 ℃下固定过夜；随后用PBS 漂洗，然后加入1%锇酸在4 ℃下固定1 h；经梯度乙醇-丙酮脱水，环氧树脂包埋，制作半薄和超薄切片；醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后，采用透射电子显微镜观察大鼠皮层线粒体超微结构。

1.9 Western Blot 法检测皮层及海马组织FGF21-FGFR1/β-Klotho 信号通路相关蛋白的表达 将大鼠皮层、海马组织分别按照RIPA 裂解液∶PMSF∶磷酸化蛋白酶抑制剂A 液∶磷酸化蛋白酶抑制剂B液= 100∶1∶1∶1 的比例提取总蛋白，并用BCA 蛋白定量试剂盒检测所提取蛋白的浓度。蛋白上样量30 μg，进行电泳、转膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h；然后加入一抗后，4 ℃下孵育过夜，TBST 洗膜3 次，每次6 min；加入二抗后常温下孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次6 min；用ECL 显影液进行显影后扫描，以β-actin 为内参，采用ImageJ 软件计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值，作为目的蛋白的相对表达水平。每组实验至少重复3 次。

1.10 统计学处理方法 采用GraphPad Prism 7.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数± 标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 竹节参总皂苷对自然衰老大鼠空间学习记忆的影响 结果见图1。与对照组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期显著延长（P＜0.01），目标平台穿越次数、目标象限停留时间均显著减少（P＜0.01），首次到达目标平台路程显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，竹节参总皂苷高剂量组大鼠的逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05），目标平台穿越次数、目标象限停留时间均显著增加（P＜0.01），首次到达目标平台路程显著减少（P＜0.01）。结果表明，竹节参总皂苷可以有效减轻自然衰老模型大鼠的行为学障碍症状，改善空间学习记忆能力。

图1 竹节参总皂苷（SPJ）对自然衰老大鼠认知功能障碍的影响（±s，n=5～9）Figure 1 Effect of saponins of Panax Japonicus on cognitive dysfunction in natural aging rats（±s，n=5-9）

2.2 竹节参总皂苷对自然衰老大鼠皮层及海马神经元病理变化的影响 结果见图2。对照组大鼠的皮层及海马神经元排列整齐、大小形态及核形态正常、有少量异染色质、核仁边界清晰，多位于胞体中心。与对照组比较，模型组大鼠出现大量细胞核肿胀和固缩神经元，分布在整个皮层及海马区域，细胞核模糊甚至空泡化，小胶质细胞显著增多。与模型组比较，竹节参总皂苷低、高剂量组大鼠神经元损伤有所改善，神经元排列恢复整齐，核异质性和细胞肿胀减轻。

图2 竹节参总皂苷（SPJ）对自然衰老大鼠皮层及海马神经元病理变化的影响（HE 染色，×200）Figure 2 Effects of saponins of Panax Japonicus on pathological changes of cortex and hippocampus neurons in natural aging rats（HE staining，×200）

2.3 竹节参总皂苷对自然衰老大鼠皮层及海马神经元尼氏体变化的影响 结果见图3。尼氏体可作为神经元功能状态的标志，当神经元受损时，尼氏体减少，通过尼氏体染色数目及着色深浅可以判断神经元损伤情况。对照组大鼠皮层及海马组织神经元细胞质中尼氏体含量较多，染色深；与对照组比较，模型组大鼠皮层及海马组织神经元中尼氏体着色变浅，数量减少，表明神经元受损；与模型组比较，竹节参总皂苷低、高剂量组大鼠皮层及海马区尼氏体数量增加，染色加深，神经元损伤得到改善。

图3 竹节参总皂苷（SPJ）对自然衰老大鼠皮层及海马神经元尼氏体变化的影响（Nissl 染色，×200）Figure 3 Effects of saponins of Panax Japonicus on changes of Nissl body in cortex and hippocampus neurons in natural aging rats（Nissl staining，×200）

2.4 SPJ 对自然衰老大鼠神经元线粒体超微结构的影响 结果见图4。与对照组比较，模型组大鼠的神经元线粒体严重受损，表现为肿胀、嵴断裂或消失和线粒体空泡化；与模型组比较，竹节参总皂苷低、高剂量组大鼠的神经元线粒体膜完整，嵴排列规则，没有明显的肿胀、损伤和线粒体空泡化。

图4 竹节参总皂苷（SPJ）对自然衰老大鼠皮层中线粒体超微结构的影响（透射电镜，×20 000）Figure 4 Effect of saponins of Panax Japonicus on the ultrastructure of cortex mitochondria in natural aging rat（TEM，×20 000）

2.5 竹节参总皂苷对自然衰老大鼠皮层及海马组织中FGF21-FGFR1/β-klotho 信号通路相关蛋白表达水平的影响 结果见图5、图6。与对照组比较，模型组大鼠皮层及海马组织中FGF21 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），FGFR1、β-klotho、P-ERK 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，竹节参总皂苷低、高剂量组大鼠皮层及海马组织中FGF21 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），P-ERK、FGFR1、β-klotho 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，竹节参总皂苷可能通过FGF21-FGFR1/β-klotho 信号通路减轻FGF21 抵抗，改善自然衰老大鼠的认知功能障碍。

图5 竹节参总皂苷（SPJ）对自然衰老大鼠皮层组织中FGF21-FGFR1/β-klotho 信号通路相关蛋白表达的影响（±s，n=4～5）Figure 5 Effect of saponins of Panax Japonicus on FGF21-FGFR1/β-klotho signaling pathway related protein expression of cortex in natural aging rats（±s，n=4-5）

图6 竹节参总皂苷（SPJ）对自然衰老大鼠海马组织中FGF21-FGFR1/β-klotho 信号通路相关蛋白表达的影响（±s，n=4～5）Figure 6 Effect of saponins of Panax Japonicus on FGF21- FGFR1/β- klotho signaling pathway related protein expression of hippocamppus in natural aging rats（±s，n=4-5）

3 讨论

衰老是自然发生的生物过程，伴随身体功能和认知能力下降。认知功能下降是导致老年人生活质量降低的重要因素。本研究通过Morris 水迷宫实验表明，衰老大鼠的逃避潜伏期显著延长，目标平台穿越次数、目标象限停留时间均显著减少，首次到达目标平台路程显著增加，提示其学习记忆能力受损，认知功能出现障碍。

FGF21 是成纤维细胞生长因子家族的一员，在维持机体葡萄糖和脂质代谢稳态中发挥关键作用[8-9]。同时，FGF21 也是衰老相关疾病潜在的生物标志物[10]。研究[11]发现，FGF21 可以增加海马突触可塑性和预防认知能力下降，发挥神经保护作用。外源性给予FGF21 可以减轻D-gal 处理小鼠的海马神经元损伤，降低MDA 和ROS 水平，提高大脑学习记忆能力[12]。FGF21 还可以有效改善Aβ 模型中神经元异常凋亡和tau 过度磷酸化，进而改善AD 大鼠认知功能障碍[13]。研究[14-15]显示，血清FGF21 水平随着衰老而升高，附睾脂肪组织中FGF21 的受体——成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）和辅助受体β-klotho（一种跨膜糖蛋白）蛋白表达水平随着年龄增长而明显下降，且FGF21 下游的磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶（P-ERK）通路激活受到抑制，提示衰老过程中机体会出现FGF21 抵抗。还有研究[16]发现，糖尿病小鼠胰岛中的β-klotho 表达呈年龄依赖性下调，给予罗格列酮治疗可以激活PPARγ 信号，进而阻止β-klotho 表达水平下调，并减轻FGF21 抵抗。本研究结果表明，自然衰老大鼠皮层和海马组织中FGF21 蛋白表达水平明显升高，而FGFR1、β-klotho及P-ERK 蛋白表达水平明显降低，提示衰老大鼠出现FGF21 抵抗；给予竹节参总皂苷干预后，皮层和海马组织中FGF21 蛋白水平明显降低，FGFR1、β-klotho 及P-ERK 蛋白表达水平明显升高，FGF21 抵抗得到明显改善。

研究[17]表明，衰老与线粒体结构和功能的变化密切相关，线粒体膜结构随着年龄增长发生依赖性变化，例如嵴和内膜囊泡的消失。同时，编码线粒体蛋白的基因转录水平随着年龄增长而下降，并伴随着神经退化和认知功能障碍[18]。研究[19]发现，银杏叶提取物（EGb 761）在AD 动物模型中通过改善线粒体功能障碍，可以逆转与年龄相关的认知功能障碍。给予FGF21 也可以减轻脑线粒体功能障碍和脑细胞凋亡，防止肥胖大鼠的认知能力下降[11]。衰老伴随着神经元损伤，给予白杉醇可防止D-gal 诱导的小鼠神经元丢失，增加尼氏体的数量，并增强空间学习和记忆能力[20]。本研究通过尼氏染色显示，衰老大鼠的皮层和海马神经元尼氏体颜色变浅，神经元数量明显减少；电镜结果显示，衰老大鼠的神经元线粒体肿胀、嵴断裂或消失；衰老模型大鼠出现认知功能障碍，并伴随神经元线粒体明显损伤。给予竹节参总皂苷干预后，衰老大鼠的神经元损伤得到明显改善，尼氏体数量明显增加，神经元线粒体膜完整，嵴排列规则，线粒体结构损伤明显减轻，空间学习记忆能力得到明显改善。

综上所述，竹节参总皂苷能有效改善自然衰老大鼠的认知功能障碍，同时改善其皮层及海马组织病理变化，提高神经元尼氏体数量，主要作用机制可能与通过FGF21-FGFR1/β-klotho 信号通路减轻FGF21 抵抗，并改善神经元线粒体结构损伤有关。