参贝北瓜颗粒对支气管哮喘大鼠气道炎症和肺组织病理变化的影响

区展龙，陈玉珍，叶嘉丽，陈晓兰，卢影雪，张悦，涂兴明（. 广州中医药大学，广东 广州 5005；.广州中医药大学第三临床医学院，广东 广州 5005；.广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 5078；.茂名市人民医院，广东 茂名 55000）

支气管哮喘是由多种细胞包括嗜酸性粒细胞（Eosinophil granulocyte basophil，EO）、淋巴细胞（Lymphocyte， LYMP）、 中性粒细胞（neutrophil，NEUT）、气道上皮细胞以及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，同时伴有气道上皮损伤和脱落，气道壁增厚变硬及黏膜分泌旺盛，随着病程的发展，最终可导致气道重塑[1]。

目前，控制哮喘气道炎症的推荐药物为糖皮质激素，长期使用会导致较多的不良反应限制了它的临床使用。参贝北瓜颗粒是广州白云山潘高寿药业股份有限公司生产的中成药，由1994 年经国家卫生部批准为首批中药保护品种的参贝北瓜膏经制剂工艺改良而成[2]。因其颗粒剂更有利于运输、贮存，可克服久置易霉败变及利于吸收等优点在临床广泛使用。组方中，君药北瓜，补中益气、调理肠胃，作为治疗哮喘的民间验方在上海地区使用历史悠久，在《上海市中药饮片炮制规范》各版本均有记载。臣药党参，补中益气、健脾益肺、和胃生津，祛痰止咳；南沙参，养阴清肺、益胃生津、化痰益气。佐药浙贝母，清热化痰，散结解毒。使药干姜，温中散寒、回阳通脉、温肺化饮[3]。多用于肺脾气虚之咳嗽、痰多、气短或乏力，相当于西医的慢性支气管炎、支气管哮喘和肺气肿，可作为支气管哮喘的辅助用药或缓解期的预防用药。

本研究采用卵清蛋白诱导SD 大鼠哮喘模型，与控制哮喘气道炎症的常用药布地奈德作疗效对比，探究参贝北瓜颗粒对支气管哮喘大鼠气道炎症及肺组织病理学变化的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SD 雄性大鼠40 只，SPF 级，2～3 周龄，体质量（150±20）g，购于广州中医药大学动物实验中心。动物质量合格证号：44005800013747，生产许可证号：SCXK（粤）2018-0034，使用许可证号：SYXK（粤）2018-0001，饲养于广州中医药大学动物实验中心SPF 级动物房，温度：21～24 ℃，相对湿度：55%～65%，温差≤3 ℃，压差25 Pa，洁净度：10 000 级，照明12 h，黑暗12 h。本研究经广州中医药大学伦理委员会批准，批准号：20221029001。

1.2 药物及试剂 参贝北瓜颗粒，广州白云山潘高寿药业股份有限公司，批号：2106001；吸入用布地奈德混悬液，四川普锐特药业有限公司，批号：SA22013；卵清蛋白，美国Sigma 公司，Grade V，CAS：9006-59-1，批号：SLCH2414；大鼠卵蛋白特异性IgE ELISA 试剂盒，江苏晶美生物科技有限公司，CAS：JM-02200R1，批号：202203；氢氧化铝粉末，上海麦克林公司，CAS：21645-51-2，批号：C12879205。

1.3 仪器 海尔YS-10 双泵雾化器，海尔股份有限公司；自制雾化箱（47.5 cm×35 cm×23.5 cm）；TDL5M-II 低速冷冻离心机，上海本昂科学仪器有限公司；RT-2100 酶标分析仪，雷杜生命科学股份有限公司；XN-1000 血细胞分析仪，日本SYSMEX公司。

1.4 剂量设计 参照魏伟等主编的《药理实验方法学》第4 版[4]，参考实验动物与人体之间等效剂量折算方法，确定参贝北瓜颗粒的剂量为10 g·kg-1和20 g·kg-1，分别相当于成人剂量的4 倍和8 倍。布地奈德的剂量为0.03 mg·kg-1，相当于成人的日用量。

1.5 分组、给药及模型复制 40 只SD 雄性大鼠适应性喂养7 d 后，随机分为空白组、模型组、布地奈德组及参贝北瓜颗粒高、低剂量组（简称参贝北瓜高剂量组和参贝北瓜低剂量组），共5 组，每组8 只。大鼠哮喘模型复制参照有关文献方法[5-6]并略作改动：除空白组外，其余组于第1 天和第14 天在大鼠四肢内侧皮下和腹腔注射致敏液（每毫升生理盐水含OVA 100 mg 和氢氧化铝粉末100 mg），每点0.2 mL，共1 mL。第21 天起采用1 % OVA 溶液连续雾化激发7 d，每日1 次，每次30 min。每次雾化激发前，空白组与模型组以生理盐水雾化吸入30 min，布地奈德组以布地奈德雾化吸入30 min，参贝北瓜高、低剂量组以生理盐水配制10 g·kg-1和20 g·kg-1的参贝北瓜溶液灌胃给药。

1.6 哮喘临床症状观察 于雾化激发阶段，详细观察并记录大鼠的生长状态、行为状态、哮喘发作状态，并对临床症状和体征进行量化评分。具体评分标准如下[7]：0 分，活泼安静、被毛光滑、呼吸平稳；1 分，被毛稍枯燥、呼吸平稳、安静少动；2 分，被毛稍枯燥、呼吸稍促、抓挠面部；3 分，烦躁不安、呼吸急促、抓挠面部；4 分，惊恐吱叫、呼吸急促、弓背收腹、腹肌痉挛；5 分，精神萎靡、蜷缩不动、被毛枯槁、点头呼吸；6 分，倒地抽搐甚至死亡。

1.7 血清卵清蛋白特异性免疫球蛋白（OVA-IgE）含量测定 于末次雾化激发后24 h 内，各组大鼠用2.0 mL·kg-1的戊巴比妥钠行静脉注射麻醉。腹主动脉采血后离心（离心半径8 cm，2 000 r·min-1，离心15 min），取上清液，-20 ℃保存，ELISA 法测定血清OVA-IgE 浓度。

1.8 支气管肺泡灌洗液（BALF）的白细胞分类计数测定 大鼠仰卧位固定于手术台上，打开胸腔。钝性分离并充分暴露气管、主支气管，暴露双肺。于主气管开一小横切口，用剪断针尖的10 mL 注射器针头插入左肺主支气管中，结扎固定，用5 mL 预冷的生理盐水分3 次灌洗左肺，收集BALF 灌洗液，回收率达90%以上，4 ℃离心5 min（离心半径8 cm，2 000 r·min-1），沉淀物于-20 ℃保存，备用于白细胞（white blood cell，WBC）分类计数的测定。EO 比率（%）=EO/WBC×100%。

1.9 肺组织病理学检查 剪取大鼠完整右肺组织，取10%中性福尔马林溶液适量灌注入内，使肺组织完全浸泡于固定液内。4 %多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，制备厚度为3～5 μm 的切片，行苏木精-伊红（HE）和过碘酸雪夫（PAS）染色。显微镜下直观观察HE 染色结果，以炎性细胞浸润程度（嗜酸性粒细胞为主）和支气管上皮细胞损伤程度为评价指标。采用Motic Digitab 2.0 软件测量平均光密度值，作为PAS 染色阳性评价指标。对两者染色结果作量化评分，具体评分标准分别见表1、表2[8-9]。

表1 炎性细胞浸润程度和支气管上皮细胞损伤程度评分标准Table 1 Scoring criteria for the degree of inflammatory cell infiltration and bronchial epithelial cell injury

表2 平均光密度评分标准Table 2 Scoring criteria of the average optical density

1.10 支气管壁厚度（Wat）和平滑肌厚度（Wam）的测量 在光镜下挑选有完整横断面的支气管，采用图像采集系统获取图像，参照相关文献研究[10]以区分气道各层结构定义，以Image-Pro Plus 6.0 测量支气管各部位面积，使基底膜周经（Pbm）标准化，即Wat（μm2/μm）=（支气管总面积-管腔面积）/基底膜周径、Wam（μm2/μm）=（平滑肌外缘内气管面积-平滑肌内缘内气管面积）/基底膜周径。

1.11 统计学处理方法 采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料结果以均数± 标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验，采用GraphPad Prism 8 作图，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床症状评分 结果见图1-A。本研究中未出现实验动物死亡或严重急性喘息发作。与空白组比较，模型组大鼠均表现出呼吸急促、抓挠面部、弓背收腹且遗留屎尿较多等急性哮喘发作的典型临床症状，症状评分明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，布地奈德组及参贝北瓜高、低剂量组，均可使大鼠哮喘症状有所缓解，症状评分均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与布地奈德组比较，参贝北瓜高剂量组与布地奈德组评分的差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 参贝北瓜颗粒对支气管哮喘大鼠临床症状和血清OVA-IgE 水平的影响（±s，n=8）Figure 1Effect of Shenbei Beigua Granules on clinical symptoms and serum OVA-IgE in rats with bronchial asthma（±s，n=8）

2.2 参贝北瓜颗粒对哮喘大鼠血清中OVA-IgE 的影响 结果见图1-B。与空白组比较，模型组大鼠血清中OVA-IgE 浓度明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，布地奈德组及参贝北瓜高、低剂量组均可使大鼠血清中OVA-IgE 浓度明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。但参贝北瓜高剂量组和参贝北瓜低剂量组效果不如布地奈德组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 参贝北瓜颗粒对BALF 中炎性细胞和嗜酸性粒细胞的影响 结果见表3。与空白组比较，模型组大鼠各类炎性细胞，包括WBC、NEUT、LYMP、EO 及EO 比率均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，布地奈德组及参贝北瓜高、低剂量组均可使各类炎症细胞数及EO 比率降低（P＜0.01），但参贝北瓜高剂量组和参贝北瓜低剂量组效果不如布地奈德组（P＜0.01）。

表3 参贝北瓜颗粒对支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎性细胞数的影响（±s，n=8）Table 3 Effect of Shenbei Beigua Granules on inflammatory cells in BALF（±s，n=8）

表3 参贝北瓜颗粒对支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎性细胞数的影响（±s，n=8）Table 3 Effect of Shenbei Beigua Granules on inflammatory cells in BALF（±s，n=8）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与布地奈德组比较，△△P＜0.01

组别空白组模型组布地奈德组参贝北瓜高剂量组参贝北瓜低剂量组剂量/（g·kg-1）--0.03 mg·kg-1 10 20 WBC/（×105·mL-1）4.93±0.35 18.10±1.04**7.60±0.39##11.83±0.66##△△14.32±0.56##△△NEUT/（×105·mL-1）1.48±0.10 6.73±0.36**2.43±0.14##4.23±0.26##△△5.24±0.18##△△LYMP/（×105·mL-1）0.99±0.05 6.02±0.07**1.82±0.05##3.23±0.06##△△4.23±0.07##△△EO/（×105·mL-1）0.48±0.05 3.83±0.10**0.90±0.10##1.78±0.12##△△2.52±0.11##△△EO 比率/%9.92±1.00 21.22±1.08**12.62±0.81##15.06±1.07##△△17.64±1.09##△△

2.4 参贝北瓜颗粒对大鼠肺组织病理学的影响 结果见图2、图3 和表4。光镜下可见，空白组大鼠组织间未见炎性细胞浸润，支气管纤毛排列整齐，未见黏膜组织结构紊乱、脱落或其他坏死迹象，单层柱状上皮细胞呈完整的花环状。支气管内无发现黏液过度分泌现象。与空白组比较，模型组大鼠支气管上皮纤毛呈静止、倒伏、粘连，大部分脱落甚至坏死，支气管与伴行动脉间的炎性细胞浸润增多（P＜0.01），PAS 染色可见杯状细胞增生明显，黏液分泌旺盛，平均光密度评分明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，布地奈德组、参贝北瓜高剂量组、参贝北瓜低剂量组均可减轻炎性细胞浸润和上皮细胞损伤，杯状细胞增生和黏液分泌有不同程度减少（P＜0.01）。参贝北瓜低剂量组与布地奈德组比较，其炎性细胞浸润与上皮损伤程度的评分明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图2 参贝北瓜颗粒对支气管哮喘大鼠气道炎症及肺组织病理变化的影响（HE 染色，×400）Figure 2 Effects of Shenbei Beigua Granules on airway inflammation and lung pathology in rats with bronchial asthma（HE staining，×400）

图3 参贝北瓜颗粒对支气管哮喘大鼠支气管上皮杯状细胞增生及其分泌的影响（PAS 染色，×400）Figure 3 Effects of Shenbei Beigua Granules on proliferation and secretion of rat bronchial epithelial goblet cells（PAS staining，×400）

表4 各组大鼠炎性细胞浸润与上皮损伤程度评分及平均光密度比较（±s，n=8）Table 4 Comparison of inflammatory cell infiltration， the degree of epithelial injury and average optical density in rats of each group（±s，n=8）

表4 各组大鼠炎性细胞浸润与上皮损伤程度评分及平均光密度比较（±s，n=8）Table 4 Comparison of inflammatory cell infiltration， the degree of epithelial injury and average optical density in rats of each group（±s，n=8）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与布地奈德组比较，△△P＜0.01

组别空白组模型组布地奈德组参贝北瓜高剂量组参贝北瓜低剂量组炎性细胞浸润与上皮损伤程度评分/分0.50±0.54 6.00±1.07**2.38±0.92##2.88±0.99##4.50±1.31##△△平均光密度0.38±0.52 3.50±0.76**1.63±0.74##2.00±0.76##2.13±0.84##

2.5 支气管壁各层厚度变化 结果见表5。与空白组比较，模型组Pbm、Wat、Wam 均有明显增厚（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组比较，布地奈德组、参贝北瓜高剂量组、参贝北瓜低剂量组的Wat 和Wam 厚度均明显减少（P＜0.01）。与布地奈德组比较，仅发现参贝北瓜低剂量组Wat、Wam 的差异有统计学意义（P＜0.01）。

表5 各组大鼠支气管壁厚度（Wat）与平滑肌厚度（Wam）比较（±s，n=8）Table 5 Comparison of the thickness of bronchus wall（Wat）and smooth muscle（Wam）in rats of each group（±s，n=8）

表5 各组大鼠支气管壁厚度（Wat）与平滑肌厚度（Wam）比较（±s，n=8）Table 5 Comparison of the thickness of bronchus wall（Wat）and smooth muscle（Wam）in rats of each group（±s，n=8）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与布地奈德组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别空白组模型组布地奈德组参贝北瓜高剂量组参贝北瓜低剂量组Pbm/μm 1 831.94±55.57 1 928.08±88.65*1 940.39±123.43 1 995.22±75.62 1 955.63±74.32 Wat/（μm2·μm-1）59.79±2.27 77.87±2.99**67.38±3.15##69.45±1.49##72.61±2.08##△△Wam/（μm2·μm-1）15.23±1.00 22.65±1.85**18.46±1.41##18.11±1.41##20.46±1.50##△△

3 讨论

气道炎症作为哮喘的病理基础，由于反复发作，支气管黏膜上皮细胞表面纤毛出现倒伏、粘连、静止、坏死和脱落，造成支气管上皮细胞变性。受损的上皮细胞可释放各种趋化因子、肽类和脂性介质与其下的间质细胞相互作用，导致上皮细胞病理性修复和再生，基底膜内胶原组织沉积，支气管壁和平滑肌变硬和增厚。上皮再生时，黏液性导管扩张、杯状细胞及黏液腺增生肥大、黏液化生，使黏液分泌亢进，甚至在小支气管内形成黏液栓。本研究的病理学检查发现，动物模型支气管与伴行小动脉间出现炎性细胞浸润，杯状细胞增生明显，黏液分泌过度，支气管平滑肌和支气管壁厚度增加。模型动物在雾化激发过程中均出现呼吸加促、烦躁不安、抓挠面部、弓背收腹进而逐渐俯伏在一起，取出动物后可见遗留屎尿较多等急性哮喘发作的临床症状，症状评分升高明显，提示大鼠哮喘模型建立成功。

本研究中，参贝北瓜颗粒能缓解大鼠哮喘症状，减轻上皮细胞损伤及炎性细胞浸润，抑制支气管平滑肌及管壁厚度增加，杯状细胞增生及黏液分泌有所减少。作为评价哮喘气道炎症的特征物质，OVAIgE 在机体多次受OVA 刺激时产生，并可活化多种炎性细胞，加重哮喘反应[8]。本研究显示，参贝北瓜颗粒能降低哮喘大鼠模型血清OVA-IgE 浓度，BALF中各类炎性细胞及嗜酸性粒细胞比例也有所下降，表明参贝北瓜颗粒可以有效抑制气道炎症。

综上所述，参贝北瓜颗粒能有效抑制大鼠哮喘气道炎症，改善肺组织病理损伤，虽然总体疗效不如布地奈德雾化治疗，但相对于模型组，其治疗效果依然具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。本研究的不足在于，未对参贝北瓜颗粒的剂量依赖性作探究，因而未能得出疗效最佳的有效剂量，有待今后作进一步的研究。