不同施肥处理对当归酚类化合物含量的影响

张丹，董妙音，崔秀文，李金娟，冯玉喜，丁耀录，栗孟飞， （.干旱生境作物学国家重点实验室，甘肃 兰州 70070；.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州 70070；.甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所/农业质量标准与检测技术研究所，甘肃 兰州 70070；.甘南藏族自治州农业技术推广站，甘肃 合作 77000）

当归来源于伞形科植物当归Angelicasinensis（Oliv.）Diels 的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效[1]，临床上常用于治疗血虚萎黄、眩晕心悸、月经不调、虚寒腹痛、肠燥便秘等症[2]。当归含有多种类型化合物，主要包括多糖、挥发油和酚类等化合物[3]。目前，当归在我国甘肃、云南和青海等省区大面积种植，占地面积约65 万亩，年需求量约3 万吨[4-5]。

研究[6]表明，当归是一种喜肥的药用植物，通过合理配施无机肥、有机肥、微生物肥或新型肥料等可促进植株生长、减少病虫害、提高产量和品质（如提高阿魏酸、藁本内酯和挥发油含量）[7-10]。近年来，中药材安全性和有效性问题已成为产业健康发展所关注的焦点，因此，实施中药生态农业模式是中药农业发展的必由之路[11-12]。为了提高当归综合质量和可持续利用土壤，课题组前期在化肥、生物菌肥和有机肥的基础上设置7 个不同处理[磷酸二铵750 kg·ha-1（T1）、生物菌肥2 250 kg·ha-1（T2）、生物菌肥2 250 kg·ha-1+有机肥6 000 kg·ha-1（T3）、有机肥12 000 kg·ha-1（T4）、有机肥18 000 kg·ha-1（T5）、有机肥24 000 kg·ha-1（T6）和有机肥30 000 kg·ha-1（T7）]，通过对产量（如根长、根数和干质量等）和品质（如阿魏酸、藁本内酯和抗氧化能力等）形成因素、以及土壤养分变化和吸收进行了综合分析，发现生物菌肥+有机肥处理不仅可显著提高当归的产量和品质，而且有利于土壤养分的吸收利用。

多酚类化合物是一类复杂的具有多个酚羟基的次生代谢产物，在整个植物界，含有多酚或酚类的化合物及其衍生物达6 500 种以上[13]。多酚可分为两大类：一类是多酚单体，即非聚合物，包括各种黄酮类化合物、绿原酸类、没食子酸、鞣花酸等；另一类则是由单体聚合而成的低聚或多聚体，统称单宁类物质[14]。酚类化合物不仅有良好的抗氧化功能，还具有强化血管壁、促进肠胃消化、降血脂、增强人体免疫力、防动脉硬化和血栓形成，及利尿、降血压、抑制细菌与癌细胞生长等作用[15]。当归中含有较为丰富的酚类化合物，包括阿魏酸、木犀草素-7-O-芦丁糖苷、查尔酮衍生物等[16]。尽管前人就不同施肥处理影响当归活性物质积累进行了大量研究，但对酚类化合物的测定与分析较少[7，10，14]。因此，本研究在前期不同肥料（化肥、生物菌肥和有机肥）处理对当归产量和品质影响分析的基础上，进一步对当归中9 个酚类化合物进行高效液相色谱（HPLC）测定与主成分分析（principal component analysis，PCA），建立同时检测当归中9 个酚类化合物的HPLC 方法，探究不同施肥处理对当归中酚类化合物积累的影响，为当归品质提升和合理施肥提供理论支撑和科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器Waters 2998 高效液相色谱仪（美国Waters公司）；SB-5200 DTD 型超声波清洗仪（宁波新芝生物科技有限公司）；BT125D 电子天平（十万分之一，北京赛多利斯科学仪器有限公司）；BS110S 电子天平（万分之一，北京赛多利斯仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore 公司）。

1.2 试剂与材料甲醇、无水乙醇（色谱纯，美国Sigma 公司）；冰乙酸（色谱纯，天津市大茂化学试剂厂）；熊果苷（Arbutin）、儿茶素（Catechin）、表儿茶素（Epicatechin）、绿原酸（Chlorogenic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、芥子酸（Sinapic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、香豆酸（Coumaric acid）、肉桂酸（Cinnamic acid）（纯度均≥98%，上海源叶生物科技有限公司）。

1.3 试验地点、施肥试验设计试验地点位于甘南藏族自治州临潭县长川乡千家寨村（海拔2 870 m；N34°69′10"、E103°41′47"），年均降水量约650 mm，年均日照时数约2 200 h，年均气温约5.6 ℃；试验点以砂壤土为主。2021 年4 月9 日，深翻25～30 cm，使耙耱与土壤充分均匀混合，起垄覆1 m 宽膜，每个处理设置3 个小区重复（长25 m×宽8 m），将7 个处理一次性做基肥施用（表1），以岷归1 号正常种苗（根直径0.45～0.55 cm）为材料，于2021 年4 月11 日，采用三角形穴栽法栽种（每垄4 行，株行距20～25 cm，每穴1 株）。植株生长期不再施用追肥，田间统一管理。2021 年10 月25 日，采用5 点取样法采挖成药根（n= 20），流水冲洗干净后，室温阴干后备用。

表1 当归不同的施肥处理Table 1 Different fertiliation treatments on Angelica sinensis

1.4 提取方法选取阴干的当归成药根，粉碎后过0.18 mm 筛，准确称取2.0 g 粉末置于50 mL 无水乙醇中，恒温震荡（22 ℃、120 r·min-1）提取24 h，低温高速（4 ℃、8 000 r·min-1）离心10 min，离心半径为8 cm，收集上清液，连续提取3 次。合并3 次提取液，经减压浓缩（500 mbar、70 ℃、150 r·min-1）至小体积，用无水乙醇定容至5 mL，0.22 μm 微孔滤膜过滤后，4 ℃保存备用。

1.5 色谱条件Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流速：0.8 mL·min-1；进样体积：10 μL；柱温：30 ℃；检测器：二级阵列管（DAD）；检测波长：282 nm；流动相：甲醇（A）-0.5%乙酸水溶液（B），梯度洗脱程序为：0～5 min，40%～40%A；5～10 min，40%～50% A；10～13 min，50%～65% A；13～16 min，65%～80% A；16～18 min，80%～40% A；18～20 min，40%～40% A。

1.6 标准品溶液的制备分别精确称取9 个酚类化合物（熊果苷、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、香豆酸和肉桂酸）标准品各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1 000 μg·mL-1的单标储备液。按照实际检测要求，将9 个酚类化合物单标各吸取400 μL，定容为1 mL 备用，浓度为400 μg·mL-1。再分别取各单标200 μL 配制混标，定容为2 mL，得各标准浓度均为40 μg·mL-1，用甲醇将混标稀释成质量浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625 μg·mL-1的标准工作液，4 ℃保存备用。

1.7 统计与分析每个样品测定3 次，使用Microsoft Office Excel 2010 进行数据处理和制图，并用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析和主成分分析。

2 结果

2.1 线性关系及检出限对9 个酚类化合物标准品的7 个梯度浓度进行测定，以标准品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，所得线性回归方程相关系数（r）均大于0.999 5，检出限为S/N=3 时的浓度值。见表2。40 μg·mL-1混合标准品的代表性色谱图见图1。

图1 当归9 个酚类化合物混合标准品的色谱图Figure 1 Chromatogram of mixed standards of 9 phenols

表2 当归9 个酚类化合物标准品的线性关系及检出限Table 2 Linear relationship and detection limit of standards of 9 phenols standards

2.2 精密度试验精密称取1 份CK 样品，按照“1.4”项下酚类提取方法提取，在“1.5”项下色谱条件下连续进样6 次，计算6 次进样的峰面积和保留时间的RSD 值。结果表明9 个酚类化合物的保留时间的RSD＜0.92%，各峰相对峰面积的RSD＜3.16%，表明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验精密称取1 份CK 样品，按照“1.4”项下酚类化合物提取方法提取，按“1.5”项下色谱条件，于0、2、4、8、12、24 h 测定。结果熊果苷、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、香豆酸、肉桂酸峰面积的RSD＜3.92%，表明样品在24 h 内稳定性良好。

（4）精益服务理论的研究逻辑和研究过程为旅游服务研究提供了一个新的思路。基于理论、顾客和企业三维视角的理论研究技术路线能够复制到其他相关问题的研究中，如旅游服务企业的员工管理问题、旅游服务企业协同创新的动力机制与协同模式问题等。

2.4 重复性试验精密称取6 份相同样品，按照“1.4”项下方法提取，按“1.5”项下色谱条件测定。计算每份样品之间的峰面积和保留时间的RSD，结果9 个酚类化合物保留时间的RSD＜1.31%，各峰相对峰面积的RSD＜4.90%，表明该实验方法重复性良好。

2.5 加样回收率试验精密称取6 份相同样品，加入酚类化合物的标准品，按照“1.4”项下方法提取，精密吸取10 μL，按“1.5”项下色谱条件测定。计算6 份样品中9 个酚类化合物的加样回收率，结果表明9 个酚类化合物的平均加样回收率为86.2%～103.6%。

2.6 不同施肥对当归酚类化合物含量的影响不同施肥处理的当归样品中9 个酚类化合物含量的测定结果见表3。T3 处理的当归样品中阿魏酸和香豆酸含量都显著高于对照组和其他处理组，分别达到了3.56 mg·g-1和16.75 μg·g-1；T4 处理的当归样品中表儿茶素（174.87 μg·g-1）、咖啡酸（7.82 μg·g-1）和肉桂酸（15.98 μg·g-1）含量都显著高于对照组和其他处理组，T6 处理的当归样品中绿原酸（149.03 μg·g-1）含量显著高于对照组和其他处理组。此外，除了在T4和T5 处理的当归样品中未检测到儿茶素外，其他各组样品中都检测到了9 个酚类化合物。当归样品中大多数酚类化合物的含量在不同的施肥处理间存在显著性差异（P＜0.05）。各当归样品中酚类化合物的含量比较显示，阿魏酸含量最高，在2.09～3.56 mg·g-1之间；其次是熊果苷，含量在0.75～1.06 mg·g-1之间；而其他7 个酚类化合物含量在0.00～189.22 μg·g-1之间。

表3 不同肥料处理的当归中9 个酚类化合物含量Table 3 Contents of 9 phenols in Angelica sinensis under different fertilization treatments（±s）

表3 不同肥料处理的当归中9 个酚类化合物含量Table 3 Contents of 9 phenols in Angelica sinensis under different fertilization treatments（±s）

注：同一化合物不同小写字母表示差异有显著性（P＜0.05）。“-”表示未检出

肉桂酸/（μg·g-1）3.52±0.07d 10.27±0.22b 4.37±0.01c 0.89±0.07f 15.98±0.74a 2.06±0.12e 0.91±0.16f 10.12±0.49b处理方法CK T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7阿魏酸/（mg·g-1）2.70±0.03d 2.09±0.01f 2.72±0.02f 3.56±0.06a 2.94±0.04c 3.06±0.04b 2.43±0.04e 2.73±0.05d熊果苷/（mg·g-1）1.06±0.04a 0.97±0.03b 0.75±0.02d 0.83±0.01c 0.83±0.06c 0.94±0.04b 0.97±0.04b 0.92±0.05b表儿茶素/（μg·g-1）3.83±0.17g 100.11±3.64e 29.62±1.77f 106.59±0.60e 174.87±6.54a 131.18±4.00c 117.69±0.71d 155.20±0.86b儿茶素/（μg·g-1）189.22±4.14a 41.40±4.00f 102.98±6.57c 51.93±2.02e--158.72±3.36b 68.37±1.16g绿原酸/（μg·g-1）135.05±4.76b 85.42±1.54e 92.30±3.25e 85.47±5.61e 102.45±2.99d 128.65±2.85b 149.03±3.48a 110.78±3.58c芥子酸/（μg·g-1）16.62±1.51b 19.91±0.38a 15.67±0.73bc 19.52±0.77a 14.38±1.52c 10.26±0.16d 17.25±0.86b 17.40±0.66b香豆酸/（μg·g-1）12.78±0.35b 12.52±0.76b 7.38±0.41de 16.75±0.84a 6.30±0.17e 8.04±0.58d 10.37±0.39c 10.14±1.00c咖啡酸/（μg·g-1）5.67±0.52b 5.58±0.76b 6.37±0.15b 5.89±0.14b 7.82±0.24a 3.61±0.03d 4.75±0.25c 5.64±0.32b

2.7 主成分分析及综合评价

2.7.1酚类化合物主成分分析 通过对不同肥料处理的当归中9 个酚类化合物进行主成分分析，得到主成分的特征值、方差贡献率和方差累积贡献率。见表4。以特征值大于1，累计方差贡献率大于85%为提取标准，第一主成分特征值为4.38，代表施肥处理后9 个酚类化合物含量48.64%的信息；第二主成分特征值为2.35，代表施肥处理后9 个酚类化合物含26.16%的信息；第三主成分特征值为1.10，代表施肥处理后9 个酚类化合物含量10.92%的信息。前3 个主成分的累积方差贡献率达到85.72%，表明前3 个主成分可以代表当归中的大部分信息。因此，提取前3 个主成分代替当归中9 个酚类化合物，可达到酚类化合物分析时降维的目的。基于成分矩阵因子更接近于1，得到的主成分能够更好地解释变量。由表5 可知，主成分1 中儿茶素、咖啡酸、介子酸和肉桂酸成分矩阵因子分别为0.87、0.94、0.88 和0.92，均接近于1，表明代表主成分1 的信息主要由儿茶素、咖啡酸、介子酸和肉桂酸组成。主成分2 中绿原酸、表儿茶素和阿魏酸成分矩阵因子分别为0.82、0.96 和0.67，表明代表主成分2 的信息主要由绿原酸、表儿茶素和阿魏酸组成。主成分3 中香豆酸成分矩阵因子为0.61，表明代表主成分3 的信息主要由香豆酸组成。

表4 当归9 个酚类化合物成分特征值及方差贡献率Table 4 Eigenvalues and variance contribution rate of 9 phenols in Angelica sinensis

表5 当归9 个酚类化合物成分矩阵Table 5 Component matrix of 9 phenols in Angelica sinensis

2.7.2不同肥料处理的当归品质综合评价 根据当归的主成分矩阵因子除以相对应主成分特征值的开平方根，得到9 个酚类化合物成分得分。见表6。以各成分得分系数矩阵构建3 个主成分的表达函数式：

表6 当归9 个酚类化合物主成分得分系数矩阵Table 6 Principal component score coefficient matrix of 9 phenols in Angelica sinensis

F1=－0.173ZX1＋0.198ZX2－0.046ZX3－0.013ZX4＋0.214ZX5＋0.202ZX6－0.075ZX7－0.145ZX8＋0.209ZX9

F2=0.095ZX1＋0.109ZX2＋0.370ZX3＋0.436ZX4＋0.050ZX5＋0.038ZX6＋0.304ZX7－0.023ZX8＋0.090ZX9

F3=－0.453ZX1＋0.376ZX2－0.131ZX3－0.129ZX4－0.001ZX5－0.168ZX6＋0.435ZX7＋0.550ZX8－0.069ZX9

以上3 个表达式中ZX为各成分的含量，ZX1、ZX2、ZX3、ZX4、ZX5、ZX6、ZX7、ZX8、ZX9分别为标准化的熊果苷、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、香豆酸、肉桂酸的含量。用各成分的方差贡献率为权重，以3 个主成分对当归药材进行综合评价并对结果进行排序，计算其综合评价的函数为：

F=0.486F1＋0.262F2＋0.109F3。

根据综合评价函数，可计算出8 个不同肥料处理的当归中9 个酚类化合物的排序。见表7。由排序可以看出，生物菌肥2 250 kg·ha-1+有机肥6 000 kg·ha-1（T3）处理的当归酚类化合物含量排第1 位，其次是有机肥18 000 kg·ha-1（T5）处理，不施肥（CK）处理含量排位最后。

表7 不同施肥处理的当归9 个酚类化合物主成分值、综合得分和排序Table 7 The values of principal component value，comprehensive score and ranking of 9 phenols in Angelica sinensis under different fertilization treatments

3 讨论

当归是我国一味大宗药材，在我国有着悠久的栽培历史。当归中含有丰富的挥发油、有机酸类、多酚类、多糖类及氨基酸等多种生物活性成分[17]，这些成分含量的变化在当归品质评价中具有重要的意义。其中酚类化合物由于具有抗氧化、预防心血管病、抗癌以及抗衰老等作用在当归药物研发中备受青睐[18-20]。本研究建立HPLC 同时测定不同施肥处理的当归中9 个酚类化合物的方法，能够实现样品中9 个酚类化合物的快速准确测定。该检测方法检测的各酚类化合物线性相关系数均大于0.999 5，线性范围为0.625～40 μg·mL-1，检出限为0.02～0.41 μg·mL-1，RSD 为0.79%～7.69%，回收率为86.20%～103.60%，表明该方法分析准确度高、重现性好。

在当归的种植过程中，合理的施肥是保证当归产量和品质的重要举措。有效的施肥模式不仅可以促进当归生长，而且还能够增加有效活性成分的合成和积累，有利于当归成药品质的提升[6]。当归中阿魏酸是评价当归品质的重要指标之一[21]。本研究显示，在生物菌肥2 250 kg·ha-1+有机肥6 000 kg·ha-1（T3）处理的当归中阿魏酸（3.56 mg·g-1）和香豆酸（16.75 μg·g-1）含量显著高于其他处理组，可能原因是生物菌肥和有机肥的混合施肥模式不仅给种植土壤补充了一定量的有机质[22]，并且通过添加外源微生物改善了土壤微生态环境[23-25]，使得生物菌肥+有机肥处理（T3）处理的当归较其他施肥处理更有利于阿魏酸和香豆酸的合成和积累，但其具体影响机制还有待进一步研究。研究[23]表明，当归种植过程中施用生物有机肥显著改善当归根际土壤环境和细菌群落结构，可有效提高产量；施用中药渣堆肥，不仅可以提高当归中阿魏酸和藁本内酯的含量，而且还能减少当归抽薹，提高产量[7]；施用高效生物有机肥，能够适当提高土壤中有机质和有益活性菌的含量，降低当归麻口病的发病率，提高当归品质[25]。但是，如果施肥不当，则会破坏当归中各元素及产物的代谢平衡，抑制植物生长和产物合成[6]。例如，施用过多或过少的钾肥均不利于株高和根长等外部形态的发育，也不利于当归光合作用和酚类等活性成分的积累[26]。因此，选择合理有效的施肥模式对于增加当归中酚类化合物的含量、提高当归品质显得尤为重要。

主成分分析法是将多个原始变量通过线性变换分析出相互独立的少数几个主成分的一种多元统计方法，即在保留原有数据信息的基础上利用相互独立的少数指标表示多个指标的方法[27-28]。本研究釆用主成分分析法对不同施肥处理的当归中9 个酚类化合物进行了分析，共提取出特征值大于1 的3 个主成分，从3 个主成分中反映出当归中的儿茶素、咖啡酸、介子酸、肉桂酸、绿原酸、表儿茶素、阿魏酸和香豆酸是评价当归品质中酚类化合物的重要指标。通过3 个主成分的方差贡献率构建了不同肥料处理下当归品质的综合评价模型，并利用该模型分析得出不同施肥处理对当归中酚类化合物的综合评价。本研究结果将有助于优化当归种植的施肥模式，为确定最佳施肥方案和提高品质提供科学依据。

本研究建立了HPLC 法同时检测当归中熊果苷、儿茶素、表儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芥子酸、阿魏酸、香豆酸和肉桂酸9 个酚类化合物的方法。本方法中各组分分离度良好，检测快速准确，重复性好，可为当归药材的质量评价提供依据。同时，不同施肥处理对当归中酚类化合物的积累存在较大差异。主成分分析发现，生物菌肥2 250 kg·ha-1+有机肥6 000 kg·ha-1施肥处理增加了当归中酚类化合物的积累，有机肥18 000 kg·ha-1处理次之。因此，在当归的大规模种植中应推荐使用生物菌肥+有机肥的混合施肥模式。