不同产地龙脑樟枝叶化学成分分析及体外抑菌研究

李思琪　江芊　黄英　胡璇　王凯　官玲亮　于福来　庞玉新

关键词：龙脑樟；右旋龙脑；相对含量；抑菌活性；天然冰片

中图分类号：R284.1 文献标识码：A

龙脑樟[Cinnamomum camphora （L.） Presl]是樟科樟属樟的多种化学型[1]之一，通体以枝叶经阴干后提取的产物中右旋龙脑含量最高[2]。天然冰片是近乎纯净的右旋龙脑[3]，原为龙脑香科龙脑香的树干经水蒸气蒸馏而得的白色结晶[4]，现为植物樟同法而得，具有提神醒脑、清热止痛[5]之功效，可用于治疗热症神昏、惊痫痰迷、烧烫伤以及气闭耳聋等一系列五官闭症，广泛应用于医药、美容以及食品等行业。由于其主要原产地苏门答腊已禁止伐树取脑[6]导致产量下降，进口价格上升，而天然冰片过去在我国无本地出产，鉴于此，20 世纪末我国科研人员找到3 种可高效提取天然冰片的樟科植物，分别为龙脑樟、油樟以及阴香[7]，研究发现这3 种植物以龙脑樟提取的产物中天然冰片纯度最高，右旋龙脑含量在85%以上，因此可将其作为提取天然冰片的首选材料。

目前，龙脑樟的相关研究主要集中在天然冰片提取、组织培养及质量评价等方面，在产地方面的研究相对较少，不同产地的生境条件不同，生长的龙脑樟中化学成分含量具有一定差异，作为提取天然冰片的最佳植物，这种差异是影响天然冰片临床药效的重要因素。因此，寻找龙脑樟的最佳产地是今后规范种植和实现天然冰片自产的基础。张宇思等[8]对湖南、江西、浙江以及福建4 个产地的龙脑樟进行成分分析，而龙脑樟喜温喜湿，南方大部分地区气候均适宜其种植；在体外抑菌研究方面，杨鹏飞等[9]、丁雄等[10]围绕多个菌种展开研究，发现龙脑樟枝叶提取物对这些菌种均表现出不同程度的抑菌活性，尤其对能引起肺曲霉病、皮肤感染以及食物发霉等的烟曲霉、白色念珠菌以及球毛壳霉的抑菌效果更为显著，但未见对常见的食源性肠道传染性致病菌伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的报道，更无产地间的类比研究。

因此，本研究拟采用GC-MS 技术对国内8个产地龙脑樟枝叶提取物进行成分分析，并分别对3 株需氧菌伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌进行产地间体外抑菌活性比较研究，旨在为龙脑樟枝叶提取物的品质评价及天然冰片的资源开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 2～3 年生[11]龙脑樟枝叶，2021 年11 月至2022 年2 月采自湖南新晃县鱼市镇（湖南鱼市）、湖南新晃县波州镇（湖南波州）、江西安福、江西吉水、江西都昌、广东乳源、浙江余杭以及湖北远安，经广东药科大学庞玉新研究员鉴定为樟科樟属植物龙脑樟[Cinnamomumcamphora （L.） Presl]的新鲜枝叶，保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所的-80 ℃冰箱内。肠炎沙门氏菌亚种（Salmonella enteritidissubsp， G-），伤寒沙門氏菌（Salmonella typhi， G-），肠道产毒素性的大肠杆菌（Escherichia coli， G-）均购自北京北纳创联生物技术研究院。

色谱纯甲醇，北京百灵威科技有限公司；氨苄青霉素（AMP 70080200），Biosharp 生物公司；100%乙醇（分析醇），国药集团化学试剂有限公司；水为灭菌蒸馏水；水解酪蛋白胨琼脂培养基（MHA）与水解酪蛋白胨肉汤培养基（MHB）购自青岛高科技工业园海博生物科技有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）与胰酪大豆胨液体培养基（TSB）购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备 手提式高速粉碎机（YC-04A），广州金本机械设备有限公司；水蒸气蒸馏装置， 上海予申仪器有限公司； 气质联用仪（7890A/5975C），美国Agilent 公司；恒温振荡培养箱（HZQ-X160），太仓市豪诚实验仪器制造有限公司；紫外可见分光光度计（N4S），上海仪电分析仪器有限公司；SpectraMax Plus384 酶标（SpectraMax Plus384），美国Molecular Devices公司；电子天平（BSA124S-CW），赛多利斯科学仪器（ 北京） 有限公司； 立式蒸汽灭菌锅（DGL-50GI），江苏登冠医疗器械有限公司；净化工作台（SW-CJ-IF），苏州广源净化科技有限公司；电热恒温培养箱（DNP-9052BS-Ⅲ），上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 天然冰片的提取 采用水蒸气蒸馏法提取龙脑樟提取物（天然冰片），用无菌蒸馏水清洗龙脑樟新鲜枝叶表面杂质，然后用白色纱布吸干水分，并于环境温度（20±2）℃下通风、避光处阴干后[12]剪碎，每个产地样品称取400 g 置于2000 mL圆底烧瓶中，加入适量无菌水与沸石，料水比1︰12[13]，连接蒸馏装置，加热至沸腾后，设置电热套额定温度为160～169 ℃，保持微沸3 h，至不再有晶体析出，再将提取物取出置于小棕瓶内称重，并于-4 ℃冰箱内保存。

1.2.2 供试品溶液的配制 将提取物用色谱纯甲醇配制成浓度为1 mg/mL 的供试品溶液，再经0.22 μm 微孔滤膜过滤[14]后注入色谱瓶。

1.2.3 GC-MS 分析 色谱条件： 色谱柱为CYCLOSIL-B（0.25 mm×30 m， 0.25 μm）毛细管柱， 色谱柱流速1 mL/min， 载气为高纯氦气（99.999%），载气流速15 mL/min，进样量1 μL，进样口温度220 ℃，程序升温：以60 ℃为起始温度，保持2 min，5 ℃/min 升至130 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min 升至175 ℃，后运行1 min，分流比20︰1。

质谱条件：EI 源，溶剂延迟6 min，离子源温度230 ℃， 进样口温度220 ℃， 扫描范围45～500 amu。

1.2.4 供试菌悬浮液的制备 在无菌操作条件下，将低温保存的标准菌株大肠杆菌接种至灭菌后的MHB 液体培养基内，伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌接种至灭菌后的TSB 液体培养基内，并于37 ℃培养12 h，再蘸取菌液于固体培养基中划线，然后将接种板于37 ℃培养24 h，使之能形成单菌落，挑取典型单个菌落分别接种至灭菌后的MHB 和TSB 培养基中，于37 ℃培养18～24 h，用紫外分光光度计测定菌液浓度OD600 为0.6～0.7，检验纯度后用相应的培养液将菌液稀释成1×10⁷CFU/mL 的菌悬液，备用。

1.2.5 抑菌圈测定 在无菌操作条件下，将高温高压灭菌后的MHA/TSA 培养基倒入培养皿内，待其凝固后将60 μL 菌液均匀涂布在培养基表面，静置30 min，吸取20 μL 各产地药液分别滴在药敏纸片上，静置30 s 后，放在已涂菌液的培养基上，封口，倒放，恒温培养12 h，游标卡尺测量抑菌圈直径并记录。以直径大小作为判定抑菌敏感度的指标，将游标卡尺测量结果取平均值，并按《药理实验方法学》中的标准来判别[15]：直径均值小于10 mm 为抗药，等于10 mm 为輕度敏感，11～15 mm 之间为中度敏感，16～20 mm 之间为高度敏感。将20 μL 氨苄青霉素（AMP）与100%乙醇分别滴在药敏纸片上，分别作为阴性对照组和阳性对照组。

1.2.6 最低抑菌浓度（MIC）测定 在无菌操作条件下，取96孔微量板，用移液枪向每排1～11孔各加入100 μL 对应的灭菌培养基；再吸取100 μL 相应浓度的各产地药液至第1 孔中，以此孔为起始浓度，对倍稀释至第10 孔后，吸取100 μL 弃去；然后吸取100 μL 已配置的菌悬液依次加至第1～11 孔中，充分混匀[16]。1～10 孔为试验组，第11 孔不加药液为对照组，吸取200μL培养基加至第12 孔，此为空白组。共8 个产地3个菌种，每个产地重复3 次，每个菌种重复2 次。随后将96 微量孔板置于37 ℃培养，12 h 后取出，采用酶标仪测定OD600 值，与阳性、阴性对照组比较计算，抑菌率达到80%的样品浓度就为该受试菌种的最低抑菌浓度。将氨苄青霉素（AMP）和100%乙醇分别与菌液1︰1（各100 μL）加入空余孔内，分别作为阳性对照组和阴性对照组。

1.2.7 最低杀菌浓度（MBC）测定 在无菌操作条件下，将MIC 浓度及上下各一个浓度组的上述混合液各取出50 μL，置于装有相应培养基的平板内涂开，于37 ℃培养12 h，观察有无菌体生长。以无菌生长相应孔中的最低浓度即为龙脑樟粗体物对该受试菌种的最低杀菌浓度。

1.3 数据处理

结合质谱对龙脑樟枝叶提取物成分进行分析，质谱分析结果在NIST 14.L 谱库进行检索，对比定性，采用峰面积归一化法检测出各化合物的相对含量，并计算重复实验数据均值。通过SPSS 21.0 软件采用单因素方差分析（one-wayANOVA）对龙脑樟枝叶提取物的抑菌圈直径进行差异分析（P<0.05）。采用Excel 2022 软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 8 个产地龙脑樟化学成分的相对含量分析

通过GC-MS 分析，得到8 个产地龙脑樟的总离子流叠加色谱图（图1）。各组分的质谱数据经计算机检索标准谱库，采用峰面积归一化法检测出了各个化合物的相对含量，所有产地数据归纳汇总见表1，相对含量在0.1%以下的化合物未列出。结果表明，不同产地龙脑樟叶提取物在其组成和相对含量上均具有一定差异。8 个产地的共有化学成分有8 种，分别为右旋龙脑、樟脑、d-α-蒎烯、莰烯、d-柠檬烯、α-葎草烯、桉叶油醇以及4-萜烯醇。2020 版《中国药典》[17]规定天然冰片中右旋龙脑的含量不得低于96%，右旋龙脑也是影响天然冰片的临床药效的主要成分，其成分在8 个产地中的相对含量由高到低依次为湖北远安（82.47%）、江西安福（82.23%）、江西都昌（79.57%）、江西吉水（78.55%）、湖南波州（73.88%）、湖南鱼市（70.77%）、浙江余杭（70.74%）、广东乳源（41.63%）。结合其他共有成分可知，湖北远安的提取物中以右旋龙脑含量最高，α-葎草烯含量最低；广东乳源的提取物中以右旋龙脑含量最低，樟脑含量最高。此外，在其他组成成分中，相对含量较高的成分有樟脑、桉叶油醇、d-柠檬烯、α-葎草烯、1-乙烯基-1-甲基-4-丙-2-亚基-2-丙-1-烯-2-基环己烷、（1，7，7-3 甲基降冰片烷-2-YL）乙酸等。另外，α-葎草烯在浙江余杭龙脑樟中的含量明显高于其他7 个产地，樟脑在广东乳源龙脑樟中的含量明显高于其他7 个产地，对伞花烃仅在江西吉水样品中有检测出来，α-蒎烯仅在江西安福样品中未检出，β-月桂烯仅在湖南波州样品中未检出，桧烯和石竹烯仅在湖北远安样品中未检出。

2.2 龙脑樟枝叶提取物的体外抑菌活性

2.2.1 抑菌圈直径8个产地的龙脑樟枝叶提取物对3 个受试菌种的抑菌圈直径见表2，在1000 mg/mL 浓度下，均呈现出不同程度的抑制敏感性，在6 mm 药敏纸片周围均出现大小不同的清晰抑菌圈，且直径均大于10 mm，表现为中高度敏感。由表2 可知，8 个产地的龙脑樟枝叶提取物对肠炎沙门氏菌表现出的药敏性最强，其次为大肠杆菌，对伤寒沙门氏菌的药敏性相对较弱，所有产地提取物的抑菌圈与阳性对照氨苄青霉素比较均有显著性差异，而阴性对照100%乙醇并未表现出药敏性。江西吉水的龙脑樟枝叶提取物对大肠杆菌的抑菌敏感性高于江西都昌、广东乳源以及湖南波州（P<0.05）；湖北远安的龙脑樟枝叶提取物对伤寒沙门氏菌的抑菌敏感性高于江西都昌、江西吉水、广东乳源、浙江余杭以及湖南波州（P<0.05）；湖北远安的龙脑樟枝叶提取物对肠炎沙门氏菌的抑菌敏感性高于江西都昌、江西安福、江西吉水、广东乳源、浙江余杭以及湖南波州（P<0.05）。因此，江西吉水和湖北远安2 个产地的龙脑樟枝叶提取物分别对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌以及肠炎沙门氏菌的抑菌敏感度高于其他产地，且湖北远安产龙脑樟同时对2 种菌种均表现出较强的抑菌活性。抑菌圈直径大小在一定程度上直观地反映了抑菌活性敏感度的强弱，直径越大代表抑菌敏感度越强，而整体抑菌活性需结合其最低抑菌浓度和最低杀菌浓度来综合判断。

2.2.2 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC） 8 个产地的龙脑樟枝叶提取物对3 个菌种均呈现出不同的抑制作用，MIC 值在250～1250 μg/mL 之间。其中，江西安福的龙脑樟枝叶提取物抑菌效果最好（MIC 值在250～500 μg/mL之间），以江西吉水的龙脑樟枝叶提取物对大肠杆菌和肠炎沙门氏菌，江西安福和湖北远安对伤寒沙门氏菌的抑制效果最好（表3）。8 个产地中，以湖南鱼市、广东乳源、浙江余杭以及湖南波州的龙脑樟枝叶提取物对3 个受试菌种的杀菌效果最佳（MBC 值均为500 μg/mL），而江西安福的龙脑樟枝叶提取物对大肠杆菌的杀菌效果相对较差，湖北远安和江西吉水的龙脑樟枝叶提取物对大肠杆菌，江西安福对伤寒沙门氏菌以及江西都昌和江西安福对肠炎沙门氏菌无杀菌效果（表4）。

研究结果表明，不同产地龙脑樟对不同菌种的抑菌活性具有一定差异，其中，对大肠杆菌的抑菌效果表现为：江西吉水>江西都昌=湖南鱼市=江西安福=广东乳源=浙江余杭=湖南波州>湖北远安；对伤寒沙门氏菌的抑菌效果表现为：湖北远安=江西安福>江西都昌=湖南鱼市>江西吉水=湖南波州>广东乳源=浙江余杭；对肠炎沙门氏菌的抑菌效果表现为：江西吉水>江西都昌=湖南魚市=湖北远安=江西安福=广东乳源=浙江余杭>湖南波州。杀菌效果方面，除湖北远安和江西吉水的龙脑樟枝叶提取物对大肠杆菌无杀菌效果外，其余产地表现为：江西都昌=湖南鱼市=广东乳源=浙江余杭=湖南波州>江西安福；除江西安福的龙脑樟枝叶提取物对伤寒沙门氏菌无杀菌效果外，其余产地杀菌效果良好且无明显差异；除江西都昌和江西安福的龙脑樟枝叶提取物对肠炎沙门氏菌无杀菌效果外，其余产地杀菌效果良好且无明显差异。

3 讨论

本研究采用水蒸气蒸馏法提取龙脑樟枝叶提取物，简单有效，所提取的天然冰片化学成分种类多样，其中绝大多数为萜类化合物，其中以单萜和倍半萜为主，与张宇思等[8]、付宇新等[18]的研究结果一致，但在含量上存在差异，这可能与不同产地的海拔、光温水气等生长环境、种植方式以及采集方法有关。在产地研究方面，除湖南新晃和江西吉安2 个传统产地外，新增了湖北远安、江西都昌、浙江余杭以及广东乳源等地，进一步研究发现这8 个产地中，右旋龙脑的相对含量超过80%的仅有湖北远安（82.47%）和江西安福（82.23%），超过70%的有江西都昌（79.57%）、江西吉水（78.55%）、湖南波州（73.88%）、湖南鱼市（70.77%）以及浙江余杭（70.74%），仅广东乳源（41.63%）低于55%。其中，仅湖北远安含有异龙脑（0.32%），含有樟脑成分分别为湖北远安（5.41%）、江西安福（5.00%）、江西都昌（ 1.39% ）、江西吉水（ 1.60% ）、湖南波州（ 16.90% ）、湖南鱼市（ 15.84% ）、浙江余杭（12.09%）以及广东乳源（46.65%），其他共有成分的相对含量无明显差异。

在抑菌活性方面，与其他产地相比，江西吉水的龙脑樟枝叶提取物对大肠杆菌抑菌效果最好，其中抑菌圈直径与杨鹏飞等[9]的研究结果基本一致，最低抑菌浓度（MIC）与杨鹏飞等[9]、丁雄等[10]的研究结果基本一致，并在此基础上进一步研究了最低杀菌浓度（MBC），发现江西都昌、湖南鱼市、浙江余杭以及湖南波州的龙脑樟枝叶提取物在500 μg/mL 浓度均下有杀菌作用；此外新增伤寒沙门氏菌与肠炎沙门氏菌2 个常见致病菌，研究结果显示，江西安福和湖北远安的龙脑樟枝叶提取物对伤寒沙门氏菌抑菌效果最佳，江西都昌、湖北远安、湖南鱼市、江西吉水、浙江余杭以及湖南波州的龙脑樟枝叶提取物在500 μg/mL 浓度下可杀灭伤寒沙门氏菌，湖北远安的龙脑樟枝叶提取物综合抑菌效果最好；对于肠炎沙门氏菌，以湖北远安的龙脑樟枝叶提取物抑菌敏感性最高，以江西吉水的抑菌效果最好，湖北远安、湖南鱼市、江西吉水、浙江余杭以及湖南波州在500 μg/mL 浓度下均有杀菌作用，湖北远安和江西吉水的综合抑菌效果最好。不同产地的龙脑樟枝叶提取物对不同菌种的抑菌效果不同，这可能与生境条件、种植方式以及菌力强弱等因素有关，如生长在云南、广西、海南[19]等地的穿心莲抑菌效果最好，是由于这些地区的生境条件温暖湿润，适宜穿心莲的生长发育。

综上所述，8 个产地龙脑樟枝叶提取物对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌以及肠炎沙门氏菌均有抑制作用，其中对大肠杆菌的研究结果与前人基本一致。而8 个产地龙脑樟枝叶提取物的抑菌活性差异可能与右旋龙脑和樟脑的相对含量和配比有关，湖北远安、江西安福以及江西吉水的抑菌活性优于其他产地，这几个产地的龙脑樟枝叶中右旋龙脑相对含量较高，分别达82.47%、82.23%、78.55%，而樟脑含量较低，分别为5.41%、5.00%、1.60%。

伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌均属于革兰氏阴性菌。前者的内毒素注射可引起发热、白细胞减少，大量注射可引起死亡；后者是可引起急性胃肠炎[20]的人畜共患病原体，由此菌引起的急性胃肠炎在世界各国有增加的趋势，有调查表明，这与食用含此致病菌的鸡蛋和家禽有关[21]。鸡蛋和家禽是人类常用食物，从鸡蛋中检测出的沙门氏菌多种多样，其中肠炎沙门氏菌的检出率最高，为最主要的血清型[22]。因此本研究有助于降低肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌以及大肠杆菌的感染风险。

天然冰片在其原产地印尼、菲律宾以及马来西亚等东南亚地区的产量非常有限，并且随着欧盟及美国宣布禁用进口以合成冰片为原料药品[23]，天然冰片自主产业化发展已成为必然趋势，而自主产业化发展是建立在确定道地产区、规范化种植的基础上的，目前尚未确定龙脑樟的道地产区。本研究在前人的研究基础上扩大了龙脑樟产地的范围，并且探究了不同产地间龙脑樟提取物的抑菌活性差异。据悉，国内关于龙脑樟的栽培有确切产地的有贵州、江苏、福建以及台湾等[24]。本研究中的8 个产地虽涵盖了大部分的龙脑樟种植地，但尚不全面，今后将开展更深入全面的研究，以期为龙脑樟的种植发展和临床应用提供有力支撑。