基于网络药理学探究中药葛根治疗风寒感冒的分子机制

储彬彬 宋 健 孟凯强 任 娟 王煜红 张雨琴 蒙常乐 王子涵

陕西中医药大学，陕西咸阳 712046

感冒是以鼻塞、流涕、头痛、恶寒、发热、全身不适为主症的一种疾病[1]，临床以风寒和风热感冒最为常见。其中，风寒感冒在中医中被认为是因人体外感风寒邪气而引起的疾病，是由于风寒之邪外束机表，卫表阳气阻遏，肺气不能宣发导致的，多发于冬、春两季，临床表现多为恶寒发热、咳嗽、肢体酸楚、恶寒、无汗、吐稀薄白痰[2]。近年来，国家大力支持中医药传承与创新，全面推进健康中国建设，坚持推动中医药传承创新以及中西医并重的优势互补，大力发展中医药事业。基于国家名老中医运用葛根治疗风寒袭肺证[3]，本研究运用网络药理学对葛根治疗风寒感冒的分子机制进行探究。

葛根其药性甘、辛、凉，归脾、胃、肺经，有升阳止泻、生津止渴、透疹、解肌退热的作用。《伤寒论》云“太阳病，项背强几几，无汗，恶风，葛根汤主之”，提出葛根汤为治疗风寒表实证的代表方之一，其中，葛根为葛根汤中的君药，是针对主病、主证起主要治疗作用的药物[4]，因此认为葛根单味药对风寒感冒也有一定的治疗作用。本研究旨在采用网络药理学方法揭示葛根这味中药治疗风寒感冒的重要成分和相关基因靶点，并探究其发挥的重要作用，在归纳葛根有效成分的基础上，对葛根的功能和功效进行整理叙述，为临床上运用葛根治疗风寒感冒提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 葛根有效成分及相关靶点筛选

通过TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[5]以葛根为检索词，获取葛根的有效化学成分和靶点基因。因符合Lipinsiki 五规则的药物具有较好的ADME 性质[6]，故限制：口服利用度≥30%，类药性≥0.18，以此筛选有效化学成分及相关基因。筛选结束后，为标准化蛋白质靶点信息，将上述主要化学成分的蛋白质统一在STRING11.5 数据库（https://string-db.org）[7]中转化为基因名对其进行规范，并运用CytoScape3.9.1 构建有效成分-靶点网络图。

1.2 风寒感冒靶点筛选

在GeneCards 数 据 库（https://www.genecards.org）[8]中以“common cold”为关键词检索，筛选出与风寒感冒相关的疾病靶点，以相同方法在TTD 数据库（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）[9]中检索与风寒感冒相关的疾病靶点，合并从上述两个数据库中获得的疾病靶点，删除重复的疾病靶点，从而建立风寒感冒疾病数据库。为提高数据的精准性，以Score 值的中位数为标准，选取Score 值大于等于中位数的疾病靶点作为研究的主要靶点。

1.3 葛根治疗风寒感冒的靶点获取

为了更加直观地表现出药物靶点和疾病靶点之间的关系，将靶点数据输入R 语言，对葛根和风寒感冒二者的靶点取交集，获取葛根治疗风寒感冒的靶点并制作韦恩图。

1.4 葛根-风寒感冒PPI网络构建

在STRING11.5 数 据 库（https://string-db.org）中选择Multiple proteins，输入葛根治疗风寒感冒的靶点基因，将生物种类设定为“Homo sapiens”，所需的最小交互分数设为中等信任度（0.400），要显示的最大交互数量第一层和第二层都选择不超过20 个，并选择隐藏断开链接的节点，其余设置均为默认设置，即得到PPI 网络。

1.5 葛根治疗风寒感冒靶点的生物过程和通路的富集分析

生物学信息注释数据库（DAVID，https://david.ncifcrf.gov）[10]和Metascape 平 台（http://metascape.org/gp/index.html）[11]都是大规模的基因和蛋白富集工具，具有较为全面的注释功能。将葛根治疗风寒感冒的靶点分别录入DAVID 平台和Metascape 平台，设置P＜ 0.01，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，将两个数据库得出的数据进行相互补充得到最终数据，将最终数据中排名靠前的数据制作成气泡图，并运用CytoScape3.9.1 构建“GOBP-基因-KEGG”网络图。

2 结果

2.1 葛根有效成分靶点的获取

通过TCMSP 数据库初步提取葛根化学成分18 种，靶 点398 个，经ADME 性 质 筛 选 后 共获得3 种有效化学成分，分别为formononetin、3'-Methoxydaidzein、beta-sitosterol，有 效 靶 点 有NOS2、PPARG、PTGS2、PTGS1 等54 个，见图1。

图1 葛根有效成分-靶点网络图

2.2 风寒感冒靶点的获取

从Genecards 数据库中获得有关风寒感冒的靶点2790 个。在Genecards 数据库中，Score 值越高则代表该靶点与疾病联系越密切，因此以Score 值的中位数为标准，大于等于Score 值中位数的目标靶点为所需要的靶点。通过计算靶点的Score 值中位数为0.7048，故设定Score ≥0.7048 的靶点为风寒感冒的靶点，再结合OMIM、TTD 数据库补充相关靶点，合并后删除重复值，最终得到1242 个靶点。

2.3 获取葛根治疗风寒感冒的靶点

将上述筛选出来的葛根有效成分靶点和风寒感冒靶点数据输入R 语言，得到葛根有效成分靶点和风寒感冒靶点的交集，将得到的交集作为葛根治疗风寒感冒的重要靶点，其中有NOS2、PTGS1、PTGS2、DPP4、MAPK14、HSP90AA1、PRSS1、NOS3、JUN、PIK3CG、BCL2、PON1 共12 个靶点，见图2。

图2 葛根-风寒感冒靶点交集图

2.4 构建葛根-风寒感冒PPI网络

将得到的葛根治疗风寒感冒的12 个重要靶点输入STRING11.5 数据库，通过数据库分析即可得到葛根-风寒感冒PPI 网络图，见图3。网络中的节点代表靶点，节点与节点之间的边代表蛋白与蛋白之间的相互作用。该网络图中共有节点数51 个、边数440 条，平均节点数为17.3，聚类系数为0.751。将PPI 网络信息数据导入CytoScape3.9.1 软件中，用NetworkAnalyzer 工具进行拓扑分析，发现NOS2、PTGS1、PTGS2、MAPK14、HSP90AA1 的节点度值大于其他靶点，节点度值越大，说明该靶点与其他靶点之间相互作用关系越明显，在网络中处于越重要地位，属于核心靶点。

图3 葛根-风寒感冒PPI 网络

2.5 靶点生物过程与通路的富集分析

使用Metascape 数据平台对12 个葛根治疗风寒感冒的重要靶点进行富集分析，并用生物学信息注释数据库对数据进行补充。结果显示，葛根治疗风寒感冒的核心靶点富集有3 个分子功能（GOMF）聚类，涉及11 个条目；2 个细胞组成（GOCC）聚类，涉及3 个条目；9 个生物过程（GOBP）聚类，涉及138 个条目；6 个富集的通路（KEGG）聚类，涉及36 个条目。本研究主要对生物过程和富集通路进行分析，根据需要筛选出20 条通路和生物过程。葛根治疗风寒感冒主要生物过程有对异生刺激的反应、炎症反应、调节血液循环、细胞活化、对细菌来源分子的反应，见图4。参与的通路主要有IL-17信号通路、Th17 细胞分化、核苷酸结合寡聚化结构域样受体信号通路、血小板活化等，见图5。

图4 GOBP 气泡图

图5 KEGG 气泡图

因为PRSS1 和PON1 不参与上述生物过程和通路，所以将这两个靶点舍去，将剩余10 个靶点的数据输入CytoScape3.9.1 软件，制作“GOBP-基因-KEGG”网络图，用圆形和三角形图标表示富集的生物过程和通路，方形图标表示葛根治疗风寒感冒的重要靶点基因，图标颜色越深说明该图标代表的通路或基因的节点值越高，与葛根治疗风寒感冒的关系越密切，见图6。

图6 “GOBP-靶点-KEGG”网络图

3 讨论

葛根药性甘、辛，凉，归脾、胃、肺经，具有升阳止泻、生津止渴、通经活络、解肌退热的功效，是重要的解表药之一。解肌退热是葛根重要的功效之一，其治疗感冒发热的疗效不劣于甚至优于部分临床西药。张仲景在《伤寒论》中就提出“太阳病，项背强几几，无汗恶风，葛根汤主之”“太阳病，项背强几几，反汗出恶风者，桂枝加葛根汤主之”[12]，多次提出运用葛根治疗外感风寒。现代临床上，信洪利等[13]通过临床试验证明对风寒感冒患者，使用桂枝葛根方联合对乙酰氨基酚混悬液比单纯使用对乙酰氨基酚混悬液疗效显著，王婧等[14]通过随机双盲对照研究证实西药联合加减葛根汤治疗外感风寒内蕴郁热型急性支气管炎比单纯西药治疗的效果更佳。动物实验亦表明葛根在SD 大鼠的发热模型、炎症模型、热辐射甩尾实验中发挥了解热、镇痛、抗炎的作用[15]。

本研究通过网络药理学方法，首先从中药数据库中筛选葛根的有效成分及靶点并构建“有效成分- 靶点”网络，然后将葛根的作用靶点与风寒感冒相关的疾病基因进行比较分析，发现葛根和风寒感冒共有12 个相同靶点，将这12 个相同靶点作为葛根治疗风寒感冒的重要靶点。在STRING11.5 数据库上构建葛根治疗风寒感冒的PPI 网络图，然后将得到的PPI 网络图的数据输入CytoScape3.9.1 软件中进行拓扑分析，发现NOS2、PTGS1、PTGS2、MAPK14、HSP90AA1 的节点度值大于其他靶点，属于葛根治疗风寒感冒的核心靶点。其次对这5 个核心靶点进行具体分析，一氧化氮合酶（NOS）作为一种同工酶，通常分布于内皮细胞、巨噬细胞和神经吞噬细胞中，NOS2 能够刺激自然杀伤细胞的细胞毒性或干扰素（IFN）-γ释放，并且NOS2 衍生的NO 是细胞因子信号传导和先天免疫功能的先决条件[16]。前列腺素-过氧化物内酯合酶（PTGS）是前列腺素生物合成的关键酶，可以将花生四烯酸转化为前列腺素H2，前列腺素H2 进一步代谢为前列腺素，PTGS 有两种亚型，分别为PTGS2 和PTGS1，前者与损伤、炎症有关，后者参与前列腺素的产生，前列腺素作为非甾体抗炎药（如阿司匹林和吲哚美辛）的靶位点，非甾体抗炎药主要通过抑制PTGS 阻断前列腺素的合成进而发挥抗炎、止痛和解热的作用[17]。丝裂原活化蛋白激酶-14（MAPK14）是MAPK 家族的重要成员之一，MAPK 通路是细胞应激、炎症、凋亡等信号转导通路的共同交汇通路之一，并且MAPK 是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，当机体受到如生长因子、细胞因子、渗透压、紫外线刺激等因素的刺激时，可通过活化MAPK14 蛋白来激活p38MAPK 通路，从而启动炎症级联反应[18]。HSP90AA1 是HSP90 蛋白的诱导形式，HSP90 蛋白是细胞中必不可少的分子伴侣之一，在信号转导、蛋白质折叠、蛋白质降解和形态进化中具有关键作用，有研究表明HSP90AA1 分子不仅可以抑制部分感冒病毒的入胞，还可抑制部分感冒病毒的复制[19]，对治疗感冒有重要的指导意义。

对葛根治疗风寒感冒的12 个重要靶点进行GO 富集分析，获得的GOBP 显示其以参与免疫应答为主，如细胞分泌、炎症应答、白细胞激活、对细胞因子的反应等，并且感冒的主要病因为病毒或细菌感染，而GOBP 分析得到的生物学过程大部分涉及于炎症反应、免疫反应等，因此认为葛根对风寒感冒具有治疗作用。通过对KEGG 富集通路进行分析，NOD 样受体信号通路中的NOD 蛋白能够诱导促炎和抗菌反应，近年来越来越多的研究显示，NOD 蛋白不仅能检测各种病原体并产生先天免疫反应，还能影响适应性免疫反应[20]。白细胞介素17（IL-17）家族是由IL-17A-F 组成的细胞因子亚群，在急性和慢性炎症反应中均起到关键作用，IL-17A 和IL-17C 在保护宿主免受细胞外病原体侵害方面具有重要作用，IL-17F 主要参与黏膜宿主防御机制[21]。Th17 细胞分化参与上皮细胞和中性粒细胞介导的针对细胞外微生物的免疫应答以及自身免疫性疾病的发病机制，并且Th17 分化的抑制可作为一种保护策略来“微调”IL-17 表达，使其不会引起过度炎症。

综上所述，本研究通过网络药理学分析葛根治疗风寒感冒的有效成分、靶点、生物学过程和富集通路等信息，为葛根治疗风寒感冒提供了一定的理论基础。