基于网络药理学探讨香附治疗桥本氏病作用机制

李心爱 张旭帆 袁姣姣 商建伟 姚思淼 黄 盛 杨泽佩 王 前 娄文凤马文源 司新颖 耿文倩 祁 烁 丁治国

1.北京中医药大学东直门医院甲状腺病科，北京 100700；2.北京中医药大学孙思邈医院甲状腺病科，陕西铜川 727100；3.北京中医药大学孙思邈研究所，陕西铜川 727100

桥本氏病（Hashimoto’s disease，HT）以甲状腺自身特异性自身抗体为特征，尽管已经明确了许多可能引发自身免疫反应的遗传和环境因素[1]，但是HT 的确切致病机制仍然未知，HT 的治疗目前侧重于疾病的临床症状。对于其发病机制有待进一步研究。

香附始载于魏晋《名医别录》[2]，味甘、微寒、无毒。一名薃，一名候莎，其实名缇。生田野，二月、八月采。”临床多用于肝气郁结月经不调、痛经、胸胁胀痛、乳房胀痛、癥瘕疼痛等[3]。现代研究表明[4]，香附对中枢神经系统有一定的影响，有解热镇痛、降温等作用，另外还有雌激素样作用，抑制子宫收缩、抗炎、抗菌、增强活血化瘀功效。临床上用香附治疗HT 的越来越丰富，但是香附治疗本病的作用机制尚未明确，本文应用网络药理学的研究方法构建靶标-通路网络以研究潜在的分子作用机制，为进一步探讨香附治疗HT 的临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 软件与数据库

使用的数据库为中药系统药理学数据库与分析平 台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、GeneCards、人类在线孟德尔遗传数据库（online Mendelian inheritance in man，OMIM）、Uniport、Venn、STRING、靶点数据库（therapeutic target database，TTD）、R 软件及安装包clusterProfiler（x64 version 3.6.1）。

1.2 香附活性成分的筛选及靶点的获取

在TCMSP（https: //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）数据库中查询香附的化学成分，OB 与OL 为常用的活性成分筛选指标[5]，本研究设置OB ≥30%、DL ≥0.18 得到相关活性成分，并使用UniProt 数据库（www.uniprot.org/）查询香附化合物分子靶标及基因编号，进而对基因进行分析。

1.3 HT疾病相关靶基因的获取

以“Hashimoto’s disease”为关键词在GeneCards及OMIM 数据库检索相关疾病基因，将其整合，删除重复基因，最终获得靶基因。

1.4 香附与HT的交集靶点

将药物有效成分的相关靶点与疾病的靶点导入Venn 平台，绘制Venn 图。

1.5 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

将所得的药物-疾病的交集靶点导入STRING数据库，导出PPI 网络，进行蛋白质相互作用统计。

1.6 基因本体论（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

为进一步研究香附的作用机制，利用R 软件及clusterProfiler 对香附治疗HT 的靶点进行GO 和KEGG富集分析，探讨香附治疗HT可能的作用机制。

1.7 分子对接验证

选择“疾病-药物靶标网络”中的关键成分和PPI 网络中的关键靶蛋白，利用AutoDUCK Vina 进行分子对接验证，以评价香附化学成分与关键靶点之间的对接效果。

2 结果

2.1 香附活性成分筛选

在TCMSP 数据库中以“xiangfu”为检索词进行查询，得到108 个活性成分，初步筛选出18 个活性成分。

2.2 HT相关靶基因的获取

在GeneCards、OMIM 数据库中检索关键词“Hashimoto’s disease”，分别获得HT 的潜在靶点858、386 个，合并所有靶点，删除重复基因，共获得969 个HT 相关基因。

2.3 构建疾病复合目标网络

通过绘制Venn 图进行交集分析，得到香附有效活性成分与HT 相关的靶点共36 个，表明香附可以通过多靶点治疗HT。将数据导入Cytoscape 3.7.2，见图1，构建疾病复合目标网络，菱形代表HT，六边形代表香附，三角形代表香附有效成分，圆形节点代表潜在目标。根据degree 值高于平均值的筛选条件，得到5 个成分可能是香附治疗HT 的关键成分，分别是槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山 奈 酚（kaempferol）、异 鼠 李 素（isorhamnetin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）。

图1 HT-香附-靶标网络

2.4 PPI网络构建与分析

将香附-HT 的交集靶点导入STRING 数据库，得到香附-HT 的蛋白互作网络。各节点的互作关系见图2。利用Cytoscape 软件的CytoNca 插件进行筛选核心蛋白基因，得到Betweennes、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC 值均大于中位数的靶点分别为胱天蛋白酶 3（caspase 3，CASP3）、低氧诱导 因 子1a（hypoxia-inducible factor-1a，HIF1A）、白介素 6（interleukin，IL-6）、表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGFA)，见图3，其中图3a 共有Score 1 共35 个节点、251 条边，图3b 共有14 个节点、83 条边，图3c 共有5 个节点、10 条边；并绘制信息柱状图，见图4。结果显示EGFR、CASP3 等靶蛋白的节点度值最高，提示此靶蛋白在蛋白互作网络中有着重要作用。

图2 基于STRING 的药物-疾病靶标相互作用图

图3 CytoNca 核心蛋白基因筛选流程

图4 关键节点信息柱形图

2.5 GO和KEGG富集分析

建立香附-HT GO 的生物过程富集分析、KEGG通路分析，见图5，根据GeneRatio 筛选出富集结果的前20 位，并绘制气泡图，见图5，图中圆圈越大，表示富集程度越高。GO 富集分析显示，香附治疗HT 的作用机制与DNA 结合转录因子、类固醇结合等生物过程相关。表明香附能够调控HT 的多种基因表达水平。

图5 GO 功能富集程度

将香附治疗HT 的靶点通过R 软件及clusterProfiler 进行KEGG 富集分析，设置阈值P＜ 0.05，共74 条，根据GeneRatio 筛选出富集结果的前20 位，并绘制气泡图，见图6。结果显示香附治疗HT 的作用机制可能与脂质动脉粥样硬化、糖尿病并发症的年龄信号通路等信号通路相关，表明香附潜在作用靶点可以通过复杂信号通路治疗HT。本研究亦发现香附可能通过干预内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、蛋白激酶C-α（protein kinase C-α，PKC-α）、适配蛋白 1（adaptor protein -1，AP-1）等靶蛋白进而干预HT，见图7。图中每个节点代表一个蛋白、基因或者酶，箭头代表上下游关系，实箭头代表直接作用关系，虚箭头代表间接作用关系，图中节点代表本通路中的蛋白、基因或者酶。

图6 关键基因KEGG 通路富集程度

图7 HT 相关信号通路

2.6 分子对接验证

选择“药物-疾病靶标”网络中的5 个关键化学成分与PPI 网络中degree 值较高的2 个关键靶点进行分子对接。将核心基因与药物成分分别输入AutoDUCK Vina 中进行分子对接，结果显示，两个核心蛋白与5 个小分子均可对接，异鼠李素与EGFR、木犀草素与EGFR 对接效果最好，见表1。

表1 分子对接结果

3 讨论

HT 在中医上归属于“瘿”“瘿病”“瘿瘤”等范畴。中药从多角度、多方面、多层次研究甲状腺疾病，具有一定的优势[6]。本研究使用TCMSP 数据库筛选出具有良好OB（≥30%）和DL（≥0.18）的化合物18 种，药物活性成分靶点8 个，分别为：菊苣醇、异鼠李素、8-异戊烯基山奈酚、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、木犀草素、槲皮素等。相关研究表明[7]，菊苣醇能够抑制小檗碱通过抑制蛋白-κB（inhibitor-κB，I-κB）/核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路并参与了金黄藻醇的抗炎作用。异鼠李素[8]具有保护心脑血管、抗炎的作用。山奈酚[9]的抗氧化/抗炎作用已经在各种疾病模型中得到证实。木犀草素[10]具有抗氧化、抗炎和抗过敏活性。

通过绘制蛋白互作网络，得到前4 个关键靶点分别为EGFR、CASP3、HIF1A、IL-6。EGFR 属于酪氨酸激酶受体家族。EGFR 信号级联是细胞增殖、分化、分裂、存活和癌症发展的关键调节剂[11]。HT中B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）反应的百分比显著低于对照组，而HT 样本中的甲状腺滤泡表现出更高程度的染色，caspase-3 与正常对照组织形成对比[12]。相关研究表明，自身免疫性甲状腺炎患者的IL-4、IL-6、IL-9、IL-13 和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）浓度显著升高，这可能会增加自身免疫性甲状腺疾病的自身免疫反应[13]。亦有研究表明[14]，IFN-γ、IL-6 和炎症通路可能促进HT 的发生和进展。

KEGG 富集结果表明，脂质动脉粥样硬化、糖尿病并发症的年龄信号通路可能是参加香附治疗HT机制的主要生物代谢过程。相关研究结果表明[15]，血脂异常和舒张期高血压加速了HT 组的甲状腺功能减退。这种影响可能是由于血脂异常和高血压导致血管内皮功能损伤和炎症反应加剧，进而影响甲状腺激素合成和代谢[16-20]。促甲状腺激素和抗甲状腺过氧化物酶抗体水平与心血管并发症直接相关。HT 患者与血脂水平密切相关，均表明脂质代谢在自身免疫性甲状腺炎中的致病作用。

综上，本研究通过网络药理学对香附治疗HT的作用机制进行挖掘，得到香附通过多活性成分、多靶点、多通路干预HT，为HT 的治疗提供新的思路，为香附的开发利用提供新的方向。