MDR1基因多态性与耐药结核的相关性研究

魏清雯 王 慧 张文丽 姚 文 万毅新

1.兰州大学第二医院呼吸科，甘肃兰州 730030；2.兰州市肺科医院二病区，甘肃兰州 730046

耐药结核在我国已非常多见，且全球感染排列靠前，其治疗的成功率为54%[1]，近几年利福平等一线药物的耐药显著增加[2]。目前其病因研究表明结核分枝杆菌耐药与其药物相关酶活性、药物靶点基因等突变有关[3]。结核分枝杆菌的耐药机制较为复杂多变，新的抗结核药物研发缓慢，部分患者无药可选[4]。感染了结核分枝杆菌（mycobacteria tuberculous，MTB）的人群仅5%～10%发展为结核病[5]，这表明人群中对于结核病的易感性存在明显的个体差异性。研究表明人群携带有白介素-23受体[6]、白介素-17[7]、溶质载体家族11 成员1 基因[8]、人类白细胞抗原基因[9]等可能为结核易感基因，以及近年新出现的雌激素相关受体β 基因[10]等都与结核病的发展存在相关性，其中部分人类白细胞抗原基因研究涉及了耐药结核易感基因[11]。人体细胞膜上三磷酸腺苷结合盒转运蛋白家族参与药物在细胞内外的转运，其中之一为多药耐药基因1（multidrug resistance gene 1，MDR1）家族，编码了P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp），其分布在人体多部位细胞膜上，P-gp 参与药物细胞内外转运，其在药物吸收、转运、分布和清除等方面具有重大意义[12]。MDR1 基因单核苷酸多态性影响P-gp 性能，乙胺丁醇、利福平等药物又是P-gp 的底物[13]。本研究将MDR1 基 因c.2677G＞T/A（rs2032582）、c.3435C＞T（rs1045642）和c.1236C＞T（rs1128503）位点单核苷酸多态性与国内汉族肺结核患者关系进行进一步研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020 年10 月至2021 年1 月就诊于兰州市肺科医院的汉族肺结核患者共97 例，其中药物敏感肺结核38 例，耐药型肺结核59 例。耐药组中男34 例，女25 例，平均年龄（38.78±6.13）岁；药物敏感组中男20 例，女18 例，平均年龄（40.03±5.85）岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），具有可比性。本研究经过兰州市肺科医院医学伦理委员会同意，入组者均签署知情同意书。

1.2 入组标准

诊断标准为《肺结核诊断标准（WS 288-2017）》[14]、《耐药结核病化学治疗指南（2019）》[15]；初治肺结核患者：①不规则抗结核治疗小于1 个月者；②初次抗结核治疗疗程未完成者；③未使用过结核药物的患者。复治肺结核患者：①复发或初治失败者；②抗结核药物使用不规律、不合理大于1 个月者。纳入标准：肺部影像资料证实有肺内结核病变；结培阳性且鉴定为结核分枝杆菌者；汉族。排除标准：不足16 岁者；合并尘肺、肺癌等患者；有脑膜炎等严重合并症者；合并糖尿病者；正在服用奎尼丁、维拉帕米等属于P-gp 的竞争性药物的患者；哺乳期或妊娠期者；正在服用免疫抑制药物者或有免疫系统的疾病者。

1.3 质量控制

结核菌培养和菌种鉴定由专人负责，严格按照结核病实验室相关规定进行。

1.4 方法

对全血脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）进行提取（北京天根生化科技有限公司的DP349-02），确保每份样本DNA 浓度不小于10 ng/μl，OD260/OD280=1.7～1.9，编码DNA样本并存储于1.5 ml离心管中，-20℃保存。在NCBI 数据库中查询MDR1，由诺赛基因公司完成其引物设计、合成（表1）。

表1 引物序列表

样本DNA 常温解冻后，与引物进行聚合酶链反应扩增，反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s、59℃退火30 s、72℃延伸1 min，扩增35 个循环，72℃延伸大于10 min，置于冰箱4℃保存。参照标记（DL2000）和样品各5 μl 放入凝胶胶孔，电压180 V，电泳分离，紫外灯下对照切下目的条带胶块回收（图1）；融化吸附DNA 后，用灭菌水将其溶解，制得模板。由ABI 3730xl 测序仪进行测序，得峰图和序列，分析得各位点基因型。

图1 4 例标本rs1045642 位点凝胶电泳图

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件对数据进行统计处理，符合正态分布且方差齐性的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，计数资料用[n（%）]表示，采用χ2检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药及分型情况统计

59 例耐药结核中以耐多药结核最多，占52.5%，其次为单耐药、多耐药、广泛耐药，单耐药中以耐利福平者占到80%，耐异烟肼者占20%；药物耐药情况从低到高依次是左氧氟沙星、乙胺丁醇、链霉素、异烟肼和利福平。见表2。

表2 耐药及分型情况统计[n（%）]

2.2 碱基测定结果

chromas 软件读判基因型，查找、比对后确认位点碱基峰图。

2.3 中国汉族人群次等位基因频率

从数据库查询南方汉族和北方汉族人群3 个位点基因频率，见表3。

表3 中国汉族人群次等位基因频率

2.4 耐药组和敏感组基因型Hardy-Weinberg平衡检验

对敏感结核组和耐药结核组rs1045642、rs2032582、rs1128503 位点基因型进行检验，差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表4。分别将耐乙胺丁醇者、耐利福平者设为病例组，对其敏感者设为对照组，在上述病例组、对照组中进行平衡检验，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

表4 耐药组和敏感组基因型Hardy-Weinberg平衡检验

2.5 耐药组和敏感组基因型频率分布比较

按照药物敏感结核组、耐药结核组分别对MDR1 基因上述3 个位点的等位基因、基因型频率进行比较，耐药结核组rs2032582 位点AA 基因型、rs1128503 位点AG 基因型频率明显高于敏感结核组，经χ2检验，差异无统计学意义（P＞ 0.05），见表5。因乙胺丁醇、利福平均为MDR1 的底物，将耐乙胺丁醇者、耐利福平者分别设为病例组，对其敏感者设为对照组，分别经χ2检验，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。MDR1 基因多态性可能与汉族人群耐药结核、利福平耐药、乙胺丁醇耐药的易感基因无关。

表5 耐药组和敏感组基因型频率分布比较[n（%）]

3 讨论

人体内结核分枝杆菌分代谢状态活跃、半静止状态和休眠状态，药物对不同菌群的作用各异，初治采用联合治疗并全程督导化疗，通过联合用药防止耐药结核产生。不规律使用药物、药物中断是耐药结核发生的一部分机制。耐药结核社会危害大，个体预后差，全疗程费用高昂。2012 年的流调报告中结核初治耐药率为42.7%，复治结核患者的耐药率为38.5%[16]。而在2002 年的流调报告中初治耐药率仅为18.6%[17]。十年间初治结核耐药率明显升高，说明耐药结核在人群间的传播明显增多。耐药结核的防控，需要更多可选的抗结核药物，但十年间仅有两种抗结核新药上市，且均已出现其耐药病例，进一步加大了耐药结核的控制难度。从上述数据中可看出，复治结核患者中耐药结核达93.1%（27/29），复治患者中耐药比例明显高，但仍有一定比例患者复治而不耐药达6.9%（2/29），表明复治不是耐药结核的唯一因素，所以人群对于耐药结核的易感性研究成为热点。

MDR1 基因突变可影响药物的药效学或药代动 力 学[18]。一 研 究 发 现MDR1 的c.1236C＞T 基因多态性与结核耐药有关[19]，另一研究发现其c.2677G＞A 多态性与耐药结核相关[20]。本研究对MDR1 基因多态性与中国汉族结核耐药的关系进行探讨。

本研究选取MDR1 基因rs1045642[A/C/G/T]、rs2032582[A/C/T]和rs1128503[A/G]位点进行研究，检测其基因单核苷酸多态性，通过Hardy-Weinberg平衡检验后，分别比较耐药结核组与药物敏感组、乙胺丁醇耐药组与乙胺丁醇敏感组、利福平耐药组与利福平敏感组间上述3 个位点的基因型和等位基因频率，耐药结核组rs2032582 位点AA 基因型、rs1128503 位点AG 基因型频率明显高于敏感结核组，经比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），结果与上述研究结论不完全相同。本研究与其不同之处在于选择了中国的汉族人群，研究表明MDR1 基因单核苷酸多态性可能与汉族人群患耐药结核、乙胺丁醇耐药结核、利福平耐药结核的易感基因无关。本研究不足之处在于入选病例数少，希望将来有更多致力于耐药结核机制的研究，以更好地防控耐药结核。