帕金森病患者血清miR-1976、GDF-15水平变化及与姿势步态异常型的关系

欧诒丹, 钟纯正, 高元杰, 郭春宣

帕金森病(Parkinson disease,PD)是常见进行性慢性神经系统变性病,多发于老年人,患病率仅低于阿尔茨海默病[1]。按照运动障碍可将PD分为震颤型、姿势步态异常型,两种亚型首发症状、病情程度、左旋多巴治疗反应、智能障碍和异动症发生率及预后方面存在显著差异,后者较前者常伴有严重认知缺陷[2,3]。因此及早明确PD异质性,准确评价其病情程度极为关键。生长分化因子15(GDF-15)在外周神经与中枢神经系统分布广泛,受损伤、炎症、应激等刺激时,其表达升高,起到抗炎作用,已有研究证实其能参与神经系统变性病、脑血管疾病等多种神经性疾病发生、进展过程[4,5]。另退行性神经系统疾病发生发展中,已确认miRNA起到关键作用,如重度脊髓性肌萎缩存在表达失衡的miRNA簇(miR-100-5p、miR-335-5p),而miR-16过表达靶向淀粉样蛋白前体蛋白基因参与阿尔兹海默病相关病理机制[6]。但临床实验中,检索PD与GDF-15、miRNA间关系的研究目前仍鲜有报道,本研究尝试探讨PD患者血清miR-1976、GDF-15水平变化及与其姿势步态异常型的关系,旨在为临床更有效防治PD提供参考依据,报道如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选择2020年3月-2022年10月我院PD患者76例(研究组),其中女48例,男28例,病程6个月～7年,平均(3.62±1.25)年,年龄60～78岁,平均(68.75±4.27)岁,根据帕金森病评定量表第三部分[7](UPDRS-Ⅲ)进行分型:40例震颤型,36例姿势步态异常型。纳入标准:符合《早发型帕金森病的诊断与治疗中国专家共识》[8]中PD诊断标准;年龄60～80岁;简易智力状况检查量表(MMSE)评估认知能力正常,能理解并完成相关量表评估;所有患者均停药2周或未经治疗;患者或家属知情研究,签署同意书。排除标准:精神障碍、谵妄、失语等损害认知功能的疾病;药物、脑外伤等所致继发性PD;合并多系统萎缩、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、帕金森综合征、肝豆状核变性及其他神经退行性疾病。另取本院53例健康体检者(对照组),无脑血管病、阿尔茨海默病、PD等神经系统病史,其中女32例,男21例,年龄60～80岁,平均(69.48±4.64)岁。两组性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方 法

1.2.1 血清GDF-15检测 入院次日清晨采集2 ml空腹静脉血,2 500 r/min离心15 min,分离血清,酶联免疫吸附法检测GDF-15水平。

1.2.2 血清miR-1976检测 提取血清总RNA,逆转录合成cDNA,采用美国ABI公司7300定量PCR仪进行靶基因扩散,反应体系包括10 μl SYBR Green染料、1 μl dNTPs、5 μl待测样品cDNA、2 μl Taq聚合酶、1 μl上下游引物,总反应体系20 μl,反应条件:95 ℃变性5 s,预变形10 min,70 ℃延伸30 s,55 ℃退火30 s,40个循环。并根据2-△△CT=2-(CT.miRNA-CT.U6)Time x+(CT.miRNA-CT.U6)Time 0公式计算血清miR-1976相对表达强度。

1.3 病情程度评价 根据采用H-Y分期[9]评价PD病情程度,H-Y分期Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ-Ⅴ期分别对应轻度、中度、重度。

1.4 观察指标 (1)比较两组血清miR-1976、GDF-15水平;(2)PD患者病情程度与血清miR-1976、GDF-15水平的相关性;(3)比较不同运动亚型患者临床特征资料及血清miR-1976、GDF-15水平;(4)Logistic回归分析血清miR-1976、GDF-15水平对姿势步态异常型PD的影响;(5)血清miR-1976、GDF-15水平对姿势步态异常型PD的预测价值。

2 结 果

2.1 两组血清miR-1976、GDF-15水平 研究组血清miR-1976、GDF-15水平高于对照组,另随病情程度增加,PD患者血清miR-1976、GDF-15水平逐渐升高(P<0.05)(见表1)。

表1 两组血清miR-1976、GDF-15水平比较

2.2 PD患者病情程度与血清miR-1976、GDF-15水平的相关性 Spearman相关性分析,血清miR-1976、GDF-15水平与PD患者病情程度呈正相关(r值分别为0.786、0.931,P<0.05)(见图1、2)。

图1 miR-1976与病情程度呈正相关

图2 GDF-15与病情程度呈正相关

2.3 不同运动亚型患者临床特征资料 姿势步态异常型PD患者性别、年龄、病程、受教育程度、有家族史比例及左旋多巴等效剂量与震颤型PD患者比较,差异无统计学意义(P>0.05),但姿势步态异常型PD患者H-Y分级、UPDRS-Ⅲ评分及血清miR-1976、GDF-15水平高于震颤型PD患者,MMSE评分低于震颤型PD患者(P<0.05)(见表2)。

表2 不同运动亚型患者临床特征资料比较

2.4 血清miR-1976、GDF-15水平对姿势步态异常型PD的影响 以姿势步态异常型PD(是=1,否=0)为因变量,血清miR-1976、GDF-15表达为因变量(以均值为界,≤界值=1,>界值=2),纳入Logistic回归方程,结果表明,校正H-Y分级、UPDRS-Ⅲ评分、MMSE评分后,miR-1976、GDF-15高表达是姿势步态异常型PD的独立危险因素(P<0.05)(见表3)。

表3 血清miR-1976、GDF-15水平对姿势步态异常型PD的影响

2.5 血清miR-1976、GDF-15水平对姿势步态异常型PD的预测价值 以姿势步态异常型PD患者血清miR-1976、GDF-15水平为阳性样本,震颤型PD患者血清miR-1976、GDF-15水平为阴性样本,绘制各指标预测姿势步态异常型的ROC曲线,结果显示,miR-1976、GDF-15预测姿势步态异常型PD的AUC分别为0.882、0.768;应用SPSS软件的联合应用ROC理论模式,构建各指标联合诊断的ROC模型,结果显示,联合预测AUC最大,为0.907(见图3、表4)。

图3 血清miR-1976、GDF-15水平预测姿势步态异常型PD的ROC曲线

表4 血清miR-1976、GDF-15水平对姿势步态异常型PD的预测价值

3 讨 论

目前临床主要根据临床表现诊断PD,即便是严格根据中国帕金森病诊断标准[10],仍存在较高误诊率。故寻求有效、简单的生化标志物帮助诊断PD一直是临床重点研究课题。

GDF-15为应激反应性因子之一,氧化应激、损伤、炎症发生时,经P53转录因子途径能刺激GDF-15表达,起到抗凋亡、抗炎效应[11]。Yatsuga等[12]研究发现,GDF-15能保护黑质纹状体多巴胺能神经元。唐蕴怡等[13]提出,PD主要是由膜离子通道受阻引起。另动物实验表明,GDF-15对大鼠小脑颗粒神经元膜离子通道表达具有调节作用,中枢神经系统中GDF-15扮演重要角色[14],正好印证以上结果。但神经系统中GDF-15的具体作用机制仍需进一步研究。本研究结果显示,研究组血清GDF-15水平较对照组高,且其水平与PD病情程度呈正相关。提示GDF-15能作为PD血液标志物之一,反映病情进展程度。推测原因可能为,GDF-15主要表达于巨噬细胞,人体受氧化应激、炎症、损伤时,能促进GDF-15表达;另PD发生时外周血及脑脊液中存在多种炎症因子表达,如IL-2、TNF-α、IL-1β等,而以上炎症因子均能诱导GDF-15表达,升高GDF-15水平[15]。因此,GDF-15可作为评价PD的敏感标志物之一,反映病情进展。

miRNA是一种内源性单链RNA,长度约18～25个核苷酸,能调控基因表达,参与细胞分化、增殖、代谢、凋亡等一系列生理过程[16]。已有研究表明,miR-1976在血液循环中以结合高密度脂蛋白或外切体形式存在于胞浆,其可能与多巴胺能神经元凋亡有关[17]。本研究中研究组血清miR-1976表达高于对照组,且随PD病情进展,其表达逐渐升高。提示miR-1976可能作为一种潜在的PD生物标志物。其机制可能为PINK1信号通路可与miR-1976相互作用,促进多巴胺能神经元凋亡,影响PD发展过程。PINK1是重要肿瘤表达谱基因,沉默PINK1能降低MEF2活性,促进肿瘤凋亡[18]。另有研究表明,突变引起PINK1功能失常,可导致线粒体功能障碍,诱导多巴胺能神经元凋亡,促进PD发生、进展[19]。由此推测miR-1976可能作用于PINK1信号通路,促进多巴胺能神经元凋亡,从而在PD发生发展中起到关键作用。

临床异质性是主要PD特征之一,各亚型患者预后具有明显差异,与震颤型相比,姿势步态异常型病情进展速度快,且常伴随认知损害、自主神经功能受损、睡眠障碍、疼痛等非运动症状,致残率较高,预后差,需积极治疗[20]。然而目前对不同亚型PD的产生机制仍未明确,已有报道表明,姿势步态异常型PD患者黑质、红核多巴胺能神经元脱失更为明显[21]。本研究进一步Logistic回归分析发现,miR-1976高表达是姿势步态异常型PD的独立危险因素。提示miR-1976高表达可经PINK1途径,导致更多黑质、红核多巴胺能神经元凋亡,从而引起姿势步态异常型PD。另多项研究表明,姿势步态异常型PD患者存在更严重抗氧化酶损害,氧自由基清除能力明显下降,神经元氧化应激损伤更重,从而造成预后不良[22]。GDF-15作为一种应激反应蛋白,能诱导脂肪细胞分泌大量GDF-15,保护血管;同时随前炎症细胞因子、活性氧类因子增加,可引起氧化应激反应,进一步促进GDF-15表达[23,24]。由此推测血清GDF-15水平可能通过影响氧化应激反应从而影响PD异质性。另ROC显示,miR-1976、GDF-15联合预测姿势步态异常型PD的AUC值为0.907,对应敏感度、特异度为92.50%、77.78%。进一步表明miR-1976联合GDF-15对姿势步态异常型PD具有较高预测价值,利于临床及早防治。

PD患者血清miR-1976、GDF-15表达升高,且其水平变化与PD病情程度与临床异质性类型有关,联合检测对姿势步态异常型PD具有较高预测价值,可为临床早期更积极治疗提供一定参考依据。