激光扫描共聚焦显微镜玻片高通量自动化成像的方法＊

王瑾瑜，王文娟，曹慧珍

（清华大学生命科学学院，北京 100084）

激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）在目前生物学和医学领域中对细胞、病例等微小信号进行观察和检测起到了重要的作用，是荧光成像和细胞组织分析的重要工具之一[1-2]。它是以激光束为光源，在显微镜的基础上增加了扫描单元、共轭小孔和检测单元。LSCM对荧光样品激发以后，共轭小孔排除非焦面的信号，获得高信噪比、高分辨率的图像[3]。LSCM 可以检测细胞、组织、活体等带有荧光标签的样品，可适配35 mm/50 mm/60 mm 培养皿、载玻片、腔室培养皿、孔板等培养容器，但均需人工操作。将样品放于LSCM上，用低倍镜观察并将感兴趣的区域放于视野中央，切换到所需的高倍镜下观察。

近年来，生物学的研究越来越依靠大数据说明具体的问题，这就需要保证实验的规模和数据的层次，单一的成像检测已经满足不了相关的研究，因此，高通量成像逐步兴起，在获得大量数据的同时，还可解决人工手动操作的问题。

目前高通量成像主要被用于药物研发中，样品主要以细胞为主，培养细胞以孔板为主[4-7]，它结合了高通量筛选技术的效率和细胞影像学技术的成像和分析能力，能够快速地从复杂的生物系统中收集到大量数据[8]。对于做免疫荧光的细胞和组织制作成装片，很难用目前市面上的设备进行高通量的拍摄，市面上有玻片扫描仪可进行多玻片的荧光成像和病理成像，但是均基于普通的宽场显微镜[9]，相较于LSCM 来说，这些设备分辨率低，放大倍数通常为4X、10X、20X、40X。而LSCM 的放大倍数可以达到100X，数值孔径可达1.49。对于一些比较简单的细胞计数，普通玻片扫描仪也可以达到实验目的，但是对细胞结构有要求的实验，必须使用LSCM，其分辨率高、信噪比高。针对这一问题，笔者使用本实验室的LSCM 以免疫荧光脾脏装片为例，介绍如何利用LSCM 进行高通量的自动拍摄。

1 LSCM 载物台适配器的设计

随着技术的发展，目前光学显微镜的载物台都是电动载物台，可以做大图拼接成像[10]，但是大部分显微镜的样品夹都只能放置单张载玻片，如图1（a）所示。需要成像的实验人员手动单张更换载玻片，延长了拍摄时间，而且需要大量的人工寻找样品信息位置。这不仅限制了多样本的检测，还限制了自动拍摄程序的应用。目前市面上也有可以采购的玻片扫描仪和做药筛的高内涵[11-12]，但是这些设备价格昂贵，成像效果一般，不够灵活。之前也有多载玻片夹持组件的设计[13]，但比较复杂，机械臂价格昂贵，不能普及到每一台光学显微镜上。

图1 显微镜通用样品适配器

倒置荧光显微镜和倒置激光扫描共聚焦显微镜电动载物台的移动范围是128 mm×86 mm，原设备厂家设计的载玻片适配器只能放一片载玻片，宽度为76 mm×26 mm。尽最大可能利用本身电动载物的移动范围设计适配器，最大容量可以放置4 个载玻片，如图1（b）所示。

2 高通量程序的应用

HCA/Jobs 是NIS-Elements 自带用于复杂图像采集和数据分析的可编写的自动化程序模块。目前针对固定样品和活细胞样品做了2 个模板，包括孔板、玻片、小皿等全部拍摄和部分拍摄，在拍摄后期直接可以增加分析和统计程序获得结果，包括Excel、柱形图、散点图等。此外，在模板之外，还会帮用户解决一些特殊的高通量实验。

2.1 实验方法

实验材料为成年的B6 小鼠，实验的仪器型号为超分辨率激光扫描共聚焦显微镜Nikon A1 HD25。实验的具体操作流程如下：①对成年B6 小鼠进行手术，取其脾脏；②冠状切面（35 μm）用低温切片机（Leica）切割；③组织切片用含有5%的BSA（牛血清白蛋白）和0.3%的Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）的PBS（磷酸缓冲盐溶液）封闭；④免疫荧光标记荧光探针；⑤尽可能多地铺展在载玻片上，滴上封片剂，盖上盖玻片，制成装片；⑥成像所需物镜为1X、20X、40X，将盖玻片朝下放置于多玻片适配器上，用螺丝固定在电动载物台上。

多玻片高通量自动化程序的编写如下：①打开NIS-Elements AR 5.2 的HCA/Jobs 模块；②选择工作区域，StageArea 确定区域rectangle 92.2 mm×38.6 mm；③确定1X 物镜下的拍摄参数（128×128 分辨率模式，单通道荧光强度和HV 确保信背比为3∶1），扫描速度为4 fps，确定高倍物镜（10X、20X、40X）下拍摄参数（1 024×1 024 分辨率模式，多通道荧光强度和HV确保信号足够亮，但不过曝）；④将低倍物镜切换到高倍物镜时，pinhole 的大小没有办法关联，可以写一个命令，在切换物镜后，通过macro 将pinhole size 调整到1.2 A U ；⑤用1 X 物镜扫描所有区域，scan stageArea.StageArea.Area；⑥使用GA 分析模块，通过therhold 将脾脏的区域选择出来；⑦将所有的区域作为一个RegionList；⑧切换20X 物镜，通过Autofocus 锁定每个脾脏的焦面，对每个脾脏进行成像。多玻片高通量拍摄程序如图2 所示。

图2 多玻片高通量拍摄程序

2.2 实验结果

编写好的多波片高通量拍摄程序会自动切换到1X 物镜下，以4 fps 的速度自动寻找每个玻片上的脾脏切片，然后定位，将选定区域加载为一个列表作为高倍镜成像的选定区域。然后自动切换到高倍镜下，转换到双通道拍摄，自动对焦，根据1X 物镜下定位的样品依次完成高倍镜大图拼接成像。即使大量样品焦面不一致，仪器也可以自动校正。成像结果如图3 所示。

图3 成像结果

3 结束语

组织切片免疫荧光染色及成像是研究组织形态和组织原位抗原表达非常重要的检测手段，被广泛应用于生物学研究和临床病例诊断的各个领域。近年来，人们对于免疫荧光成像不仅仅局限在几个样品，或者是局部位置；而且更关注原位抗原表达在整个组织切片中的位置或者数量，这就需要研究者们运用大图拼接的方式去对信号进行成像，即利用高倍镜的高分辨率，又可以通过多张拍摄拼接起来获得整体的组织图像。因此，将高通量自动化拍摄和激光扫描共聚焦显微镜联合起来，不仅利用激光扫描共聚焦显微镜获得高分辨率、高信噪比的图像，而且使用高通量的拍摄程序达到自动化、多样品的目的。科研人员只需要将样品放置于适配器上，以Z轴高度置于焦面附近，启动程序即可完成拍摄任务。

经过多次测试，成年小鼠的脾脏，一次可完成20个样品的全自动拍摄；小鼠脑片一次可完成40 个左右样品的拍摄，因此高通量自动化拍摄弥补了现在商业化共聚焦无法离开人的短板，而这也是高端精密仪器的趋势，尽量能自动化、智能化。让公共平台的仪器可达到7 d 24 h 全时段的运转，从而释放平台的服务潜能，提高仪器的使用效率。另外，本研究编写的拍摄程序只是针对多玻片的拍摄，后续可根据用户需求增加图像处理的程序。在拍摄完成之后，直接以Excel、散点图、柱形图等出示需要分析和统计的结果。该研究成果可以运用到大部分类似的激光扫描共聚焦显微镜或普通荧光显微镜上，对显微镜的配置要求是装有Nis-elements AR 5.2版本以上的软件，并包含HCA/Jobs模块，显微镜主体型号为Nikon Ti-E 或者Nikon Ti2，希望可以给相关研究提供一定的借鉴和参考。