H3型组胺受体在结直肠癌中作用研究

边振远, 王鑫宇, 张 成

北部战区总医院 普通外科,辽宁 沈阳 110016

结直肠癌是一种高度恶性肿瘤,其发病率和病死率分别排在肿瘤的第3位和第4位[1-2]。目前,针对结直肠癌的药物治疗手段比较缺乏,有待进一步开发。有研究报道,组胺作为一种内源性胺类物质,结合相应的组胺受体可以作用于肿瘤细胞的增殖,目前,已经发现的组胺受体包括H1、H2、H3、H4型组胺受体4种,组胺通过与这些不同的受体结合会发挥不同的作用[3]。人HRH3基因定位于第20号染色体,编码的蛋白由446个氨基酸组成[4]。有学者发现,H3型组胺受体(H3 histamine receptor,H3HR)具有调控肿瘤细胞增殖和迁移的作用[5]。有研究证实,肝细胞肝癌、胆管细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤组织中的H3HR表达水平显著增高[6-11]。本研究旨在探讨H3HR在结直肠癌中的作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人结直肠癌组织和癌旁组织样本来自于北部战区总医院普通外科。胎牛血清购自Gibco公司;RPMI1640培养基及0.25%胰酶由课题组专业技术人员配置;二甲基亚矾购自SIGMA公司;酒精(无水乙醇、75%乙醇)购自天津市富宇精细化工有限公司;光学显微镜购自OLYMPUS,全自动酶标仪(BIO-RAD550)购自美国bio-rad公司,离心机购自Thermo;EDU试剂购自广州锐博生物科技有限公司;H3HR干涉片段由吉玛基因公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组及干涉片段转染 (1)组织样本按照结直肠癌和癌旁组织分为10对。(2)将传代好的人结肠癌细胞HCT-116细胞分入siCtrl组和siH3HR组。siH3HR组接种细胞于6孔板中。用无血清培养基配制lip2000混合液,室温静置5 min;再用无血清培养基配制干涉片段混合液。将两种混合液混匀后静置25 min,分别加入到相应的6孔板中,正常条件下培养(37℃,5%CO2),再进行干涉片段的转染。

1.2.2 EDU实验 (1)接种细胞：将常规处理过的siCtrl组、siH3HR组细胞消化离心后以适宜密度种于24孔板中,于37℃、5%CO2培养24 h。(2)EDU标记细胞：制备50 μm EDU培养基并加入24孔板中,孵育2 h后用PBS清洗。(3)细胞固定化：加入含4%多聚甲醛的PBS,室温脱色摇床孵育30 min,然后用2 mg/ml甘氨酸溶液中和,继续加入PBS清洗,清洗结束后加入含0.5%TritonX-100的PBS,室温脱色摇床孵育10 min,最后用PBS清洗。(4)EDU反应：于24孔板中加入1×Apollo®反应液孵育30 min,然后加入含0.1%TritonX-100的PBS,重复2次,每次10 min。(5)DNA染色：配制适量1×Hoechst33342反应液并加入24孔板中,避光孵育30 min,再用PBS清洗,重复2次,每次10 min。(6)荧光显微镜获取图像进行分析。

1.2.3 细胞划痕实验 (1)接种细胞：将常规处理过的siCtrl组、siH3HR组细胞消化离心后种于6孔板中(密度为500个细胞),37℃、5%CO2培养24 h。接种细胞前用marker笔在6孔板背面画线标记。(2)细胞划痕：用20 μl中枪头垂直于孔板制造划痕,再用无血清培养基清洗划痕产生的细胞碎片。(3)观察拍照：加入无血清培养基,显微镜下观察并拍照,记录0、24、48 h的作用效果图。

2 结果

2.1 结直肠癌和癌旁组织H3HR表达水平比较 在10对结直肠癌和癌旁组织中,结直肠癌组织中H3HR表达水平高于癌旁组织。见图1。

2.2 H3HR干涉对siH3HR组、siCtrl组细胞增殖能力影响比较 H3HR干涉后,siH3HR组细胞增殖能力低于siCtrl组(P<0.05)。见图2。

2.3 H3HR干涉对HCT-116细胞迁移能力影响 干涉降低H3HR表达后,HCT-116细胞迁移能力下降(P<0.05)。见图3。

图1 结直肠癌和癌旁组织H3HR表达水平比较(T表示肿瘤,N表示癌旁)

3 讨论

HRH3可在恶性肿瘤的发生和发展过程中发挥调控作用[4,12]。Szabo等[12]发现,肾上腺皮质瘤中HRH3呈显著高表达。Cricco等[13]报道,组胺可通过结合H3和H4型组胺受体对胰腺癌细胞的生长发挥调控作用。朱剑军等[14]研究表明,H3HR通过调控伪足形成在结直肠癌中参与肿瘤迁移。恶性肿瘤细胞系和肿瘤组织中均存在着高内源性组胺,其可通过旁分泌或自分泌的方式释放到细胞间隙中,从而作用于肿瘤发生和发展的各个阶段。本研究中,Western Blot检测结果显示,结直肠癌组织中H3HR表达水平高于癌旁组织。这提示,组胺可能通过作用于H3HR调控结直肠癌的发生和发展。在后续实验中,通过构建H3HR表达干涉载体降低H3HR在结直肠癌细胞系中的表达后发现,H3HR表达降低后,HCT-116细胞迁移能力下降(P<0.05)。这提示,在结直肠癌中,组胺通过H3HR促进结直肠癌细胞的增殖和转移。

图3 H3HR干涉对HCT-116细胞迁移能力影响

本研究存在一定的不足：仅在细胞系中进行了干涉实验,降低H3HR表达后,HCT-116细胞的增殖和迁移能力出现显著下降,但对组胺通过H3HR产生促肿瘤增殖、迁移效应的具体机制并未进行深入研究。

综上所述,H3HR与结直肠癌细胞的增殖和迁移相关,这为以H3HR为靶点的结直肠癌药物开发提供了理论基础。