miR-137通过调控血红素铁输出蛋白FLVCR、BCRP对大鼠I/R损伤的保护作用*

袁莉 邓秋媚 向军军 陈炜 胡跃强 姚春

(1.广西中医药大学,广西 南宁 530020;2.广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530020)

缺血性中风(Ischemic stroke, IS)是一种致残率和死亡率很高的脑血管疾病,为全球第二大死亡原因[1]。目前,急性缺血性脑卒中可用的治疗方法是再通治疗策略。由于时间或适应症的限制,它们仅适用于少数患者,并且效果中等。此外,抗血小板药物具有高颅内出血风险,并且抗凝剂不能改善长期结果。与世界其他国家相比,我国IS的复发率最高[2]。研究[3]表明,线粒体铁死亡和miRNA等在IS的病理机制中起到重要作用。脑缺血再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤时,游离铁与血红素的过度积累,引起神经毒性和线粒体铁死亡,是卒中损伤的新机制[4]。因此研究与铁的转运相关蛋白或受体以及调控miRNA均可以作为I/R损伤的切入点。其中乳腺癌抗性蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)和猫白血病病毒C亚组受体(Feline leukenmia virus receptor,FLVCR)是新近发现的血红素铁输出蛋白,在缺血或缺氧条件下,两者的表达和功能会发生变化,导致运输屏障发生改变,调控其表达可能会对I/R损伤发挥保护作用。miR-137在神经系统疾病中起着重要而复杂的作用,可能是通过调节铁死亡对IS产生神经保护作用,但对miR-137是否通过调控血红素铁输出蛋白对IS产生作用的相关机制鲜少有报道。因此,初步探讨BCRP和FLVCR在大鼠脑I/R损伤后的表达变化以及miR-137对二者的调控作用,从而进一步了解miR-137与血红素铁输出蛋白在IS的相关机制,为改善IS的预后提供一定的实验和理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠60只(2～3月龄,250±50 g,SPF级),购自广西中医药大学实验动物中心。由长沙市天勤生物技术有限公司提供,生产许可证号:SCXK(湘)2019-0014。将大鼠饲养在温度为25 ℃、湿度为45%～65%的条件下,自由获取食物和水,适应性饲养7 d。本实验方案通过广西中医药大学动物伦理委员会批准(批准号DW20211204-195)。

1.2 试验试剂及仪器 ①主要仪器:石蜡切片机(HS-2205,山东欧莱博医疗器械有限公司),高速低温组织研磨仪(Servicebio),Stereo Drive立体定位系统(NEUROSTAR,德国),PCR扩增仪(瑞士Roche公司),高速离心机(赛默飞世尔科技,USA),光学显微镜(Olympus)。②主要试剂:rno-miR-137-3p mimics AAV和rno-miR-137-3p inhibitor AAV购自上海吉满生物科技有限公司,mRNA扩增试剂盒(上海生物科技有限公司),TRIzolTM试剂(Ambion),mRNA逆转录试剂盒、miRNA逆转录试剂盒和miRNA扩增试剂盒购自新贝生物科技有限公司,二抗山羊抗兔IgG HRP(Biosharp,中国),Anti-FLVCR抗体(上海康朗生物科技有限公司),Anti-BCRP抗体(北京Affinity Biosciences公司)。

1.3 实验分组 将大鼠随机分成假手术(Sham operation, SO)组、模型(MCAO/R)组、miR-137模拟物(Mimic)组、miR-137模拟对照(Mimic对照)组、miR-137抑制物(Inhibitor)组、miR-137抑制对照(Inhibitor对照)组(n=10)。SO组:以假手术代替缺血再灌注,仅暴露大鼠颈动脉并缝合。MCAO/R组:大鼠行大脑中动脉闭塞2 h后拔出线栓造成再灌注损伤。miR-137mimic组:颅内缺血侧MCA区注射miR-137mimic,参照大鼠脑立体定位图谱,将miR-137 mimic 2μl注射到缺血侧MCA附近;7 d后制作MCAO/R模型。miR-137mimic对照组:miR-137mimic空载体代替miR-137mimic,余操作同Mimic组。miR-137 inhibitor组:颅内缺血侧MCA区注射miR-137inhibitor 2 μL,余操作同Mimic组。Inhibitor对照组:颅内缺血侧MCA区注射miR-137inhibitor空载体,余操作同Mimic组。每只大鼠再灌注后12、24 h处死,取材大鼠缺血半暗带区脑组织。

1.4 脑立体定位 注射腺相关病毒将大鼠麻醉后固定在脑立体定位仪框架中[5]。吸取2 μL纯化后的腺相关病毒,并固定在定位仪上。将注射器针尖移至大脑中动脉标记并钻孔:AP:0,ML:-2.5 mm,DV:-3.5 mm(相对于前囟点和硬脑膜表面)。进针深度为3 mm后缓慢注射腺相关病毒miR-137mimic或miR-137inhibitor或空载体。7 d后制备MCAO/R模型。

1.5 大鼠MCAO/R模型制备 在Longa线栓法的基础上加以改良制备大鼠脑MCAO/R模型[6]。根据再灌注方案,2 h后固定大鼠把线栓拔出大约9 mm。Longa＇s评分大于1分则证实造模成功。后再按各组的处理方法处理大鼠,在12 h和24 h两个时间点处死大鼠。

1.6 检测方法

1.6.1 神经功能评分 大鼠清醒后用Zea-Longa 5级评分法对大鼠神经功能进行神经功能评分[7]。其中评分为1～3分且无蛛网膜下腔出血的大鼠进入实验,评分为0分和4分的大鼠剔除。评分越高,说明大鼠神经功能障碍越严重。

1.6.2 免疫组织化学染色 脑组织脱水和包埋,石蜡切片切成4 μm并在60 ℃烘烤2 h,将切片用二甲苯Ⅰ和Ⅱ以及梯度酒精进行脱蜡和脱水,高压修复,PBS冲洗3 min×3次,3%过氧化氢孵育10 min,PBS冲洗3 min×3次,用一抗FLVCR(1∶200)和BCRP(1∶200)37 ℃孵育60 min,PBS冲洗3 min×3次,二抗山羊抗小鼠/兔IgG室温孵育30 min,PBS冲洗3 min×3次。用DAB显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透化,中性胶封片。光学显微镜观测,每个切片随机选择6个视野。阳性细胞浆或细胞核着色呈棕黄色,采用 Image J软件检测图片的阳性细胞面积,算出AOD值[8]。

1.6.3 qRT-PCR检测 使用TRIzolTM试剂从脑组织中提取总RNA,mRNA逆转录试剂盒和miRNA逆转录试剂盒将总RNA合成cDNA。使用扩增试剂盒进行PCR扩增。以GAPDH为内参,以2-ΔΔCT法计算计算FLVCR和BCRP的相对mRNA表达水平[9]。引物序列,见表1。

表1 qRT-PCR中的引物序列Table 1 Primer sequence in qRT-PCR

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 与SO组相比,MCAO/R组大鼠评分明显升高(P<0.01);与Mimic对照组相比,Mimic组评分明显降低(P<0.01);与Inhibitor对照组比较,Ihnibitor组评分明显升高(P<0.05)。见图1。

2.2 各组大鼠脑组织miR-137、FLVCR、BCRP mRNA表达变化的比较 与SO组相比,MCAO/R组miR-137表达水平明显降低(P<0.05);与Mimic对照组相比,Mimic组miR-137表达水平明显升高(P<0.01),且以24 h升高更明显(P<0.05);与Inhibitor对照组同期比较,Inhibitor组miR-137表达水平明显降低(P<0.05)。 与SO组各时间点比较,MCAO/R组FLVCR和BCRPmRNA表达降低(P<0.05);与Mimic对照组比较,Mimic组二者表达明显升高(P<0.01),BCRP mRNA在24 h升高最明显(P<0.05);与Inhibitor对照组比较,Inhibitor组二者降低(P<0.05),FLVCR mRNA在24 h降低更明显(P<0.05)。见表2、表3。

表2 大鼠miR-137的表达量比较Table 2 Comparison of miR-137 expression in rats

表3 大鼠FLVCR、BCRPmRNA表达的比较Table 3 Comparison of FLVCR and BCRP mRNA expression in rats

2.3 各组大鼠脑组织FLVCR和BCRP蛋白表达变化的比较 SO组可见大量的FLVCR和BCRP阳性表达。与SO组同期比较,MCAO/R组二者的表达明显降低(P<0.01);与Mimic对照组比较,Mimic组二者的表达明显升高(P<0.01),且以24 h升高更明显(P<0.05);与Inhibitor对照组相比,Inhibitor组二者的表达明显降低(P<0.05)。见表4、图2、图3。

图2 12 h大鼠FLVCR、BCRP蛋白表达免疫组化图(400×)Figure 2 Immunohistochemical diagram of FLVCR and BCRP protein expression in 12 h rats 注:A.SO组;B.MCAO/R组;C.Mimic组;D.Mimic对照组;E.Inhibitor组;F.Inhibitor对照组。

图3 24 h大鼠FLVCR、BCRP蛋白表达免疫组化图(400×)Figure 3 Immunohistochemical diagram of FLVCR and BCRP protein expression at 24 h in rats注:A.SO组;B.MCAO/R组;C.Mimic组;D.Mimic对照组;E.Inhibitor组;F.Inhibitor对照组。

表4 大鼠FLVCR和BCRP的AOD值比较Table 4 Comparison of AOD values of FLVCR and BCRP in rats

3 讨论

铁元素与中风的发生和发展密切相关,I/R可导致组织的进一步损伤,这涉及铁离子稳态的改变导致细胞内铁的积累以及随之出现的一种新的程序性细胞坏死形式——铁死亡[10]。在缺氧条件下血红素的细胞浓度增加,游离血红素的存在引起有害炎症和氧化应激[11]。首先,细胞内血红素的积累最终会导致铁的积累,并通过芬顿反应(Fenton reaction)产生破坏细胞的活性氧;其次,铁和血红素的积累也会导致线粒体功能障碍[12]。细胞内血红素水平的调节是神经元存活的基础,FLVCR和BCRP作为血红素铁输出蛋白,能特异性结合或转运血红素来减少血红素的积累,在缺氧状况下能保护细胞和组织不受游离血红素的损伤,维持细胞内环境稳态,在IS中发挥至关重要的作用。本研究显示,MCAO/R组大鼠脑组织中FLVCR和BCRP蛋白表达均明显降低,提示I/R损伤可抑制脑组织中FLVCR和BCRP表达[13]。研究表明干细胞中的BCRP表达通过防止导致线粒体死亡的血红素积累来保护造血干细胞免受缺氧环境的影响,提高细胞存活能力。抑制人红细胞系中的FLVCR功能会减少血红素输出,损害红细胞成熟,并导致细胞凋亡。

miRNA可介导脑缺血再灌注损伤的发生发展[14-15]。其中miR-137可以保护神经元免受OGD/R诱导的细胞损伤[16]。星形胶质细胞中miR-137的水平从缺氧和缺糖环境到正常环境也会增加[15]。miR-137作为脑血管疾病预测的新型生物标志物[17],本研究结果显示,MCAO/R处理的大鼠脑组织中miR-137水平显著降低,表明miR-137参与了大鼠脑I/R过程,和之前的研究结果基本一致。Zhang等[18]发现miR-137过表达可减轻脑缺血大鼠脑组织损伤程度,减少氧-葡萄糖剥夺再灌注诱导的细胞损伤,有效改善局灶性脑缺血后的损伤。Liu等[19]发现miR-137可增强脑缺血性卒中小鼠内皮祖细胞的增殖和血管生成。miR-137还可能通过抑制炎症标志物的释放来减少脑梗死体积,改善MCAO大鼠的认知功能[20]。本研究中通过表达miR-137改善了MCAO/R诱导的 miR-137 水平的降低,改善了MCAO/R处理的大鼠神经功能缺损,升高FLVCR/BCRP的表达。提示miR-137能增加内源性FLVCR和BCRP水平,改善MCAO/R大鼠神经功能损伤。miR-137抑制剂使 大鼠脑组织中miR-137、FLVCR和BCRP 表达明显低于模型组,提示抑制miR-137能进一步抑制 FLVCR和BCRP的合成与表达,从而加重神经功能缺损情况。

4 结论

本研究结果提示,miR-137可能是诊断IS和预测脑血管不良事件发生的潜在临床工具。miR-137可能通过促进血红素铁转运蛋白FLVCR和BCRP水平,从而阻止脑组织铁和血红素的积累,达到保护神经元的目的。