Pifithrin-α改善异丙肾上腺素诱导心肌纤维化的作用及机制

郑高暑 胡杰 董天成 林智威 潘培培 梁诗琪 杜雷雷 孔淑婷 陈星星 龚永生 范小芳 周浩

心肌纤维化是指由于长期压力负荷增加引起大量细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）蛋白在心肌间质中过度沉积，正常心肌组织被纤维化组织替代的病理性重构过程，最终导致进行性心力衰竭[1]。研究表明，心肌组织中内皮细胞可通过内皮间质转化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）成为间充质细胞，形成大量的肌成纤维细胞促进心肌纤维化[2]。EndMT 与多种疾病的发病机制密切相关，包括心肌纤维化、系统性硬化、肺动脉高压、心肌梗死和其他纤维化疾病[3-4]。因此，调控EndMT 过程是抗心肌纤维化的重要靶点。Pifithrin-α 是一种p53 的特异性抑制剂，近期研究发现Pifithrin-α 具有抑制肾纤维化和肝纤维化的作用[5-6]。本研究探讨Pifithrin-α 改善异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）诱导心肌纤维化的作用及机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 6 周龄雄性SD 大鼠24 只，体重185～219（199.25±10.53）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。人微血管内皮细胞（human microvascular endothelial cells，HMVECs）购自中国上海细胞库。本研究经温州医科大学动物实验伦理委员会审查通过（批准文号：wydw2020-0372）。

1.2 方法

1.2.1 动物培养及分组 24 只大鼠采用信封法随机分为观察组、ISO 组和对照组，每组8 只。观察组和ISO 组采用5 mg·kg-1·d-1异丙肾上腺素（美国Sigma 公司，批号：I5627）连续皮下注射1 周，观察组再采用2 mg·kg-1·d-1Pifithrin-α（美国Sigma 公司，批号：P4359）腹腔注射1 次。对照组连续皮下注射与ISO 相同体积的0.9%氯化钠注射液1 周。3 组大鼠继续喂养3 周。实验过程中3 组大鼠均有死亡发生，在第4 周末时观察组剩下5 只，ISO组剩下4只，对照组剩下3只。

1.2.2 心脏超声心动图检查 在第4 周末时，3 组大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，采用小动物心超仪（美国Phillips 公司，Sonos 5500 型）检测3 组大鼠心功能。通过M 型超声测量心率、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall dimension，LVPWd）和射血分数（ejection fraction，EF）。

1.2.3 血流动力学分析 心脏超声心动图检查后，3 组大鼠经颈动脉插入心导管进入左心室测量左心室功能及压力。记录左心室舒张末期压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室平均收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室压力最大上升速率（maximum rate of leftventricular pressure rise，+dp/dtmax）和左心室压力最大下降速率（maximum rate of left ventricular pressure descent，-dp/dtmax）。

1.2.4 心脏重量指数测定 上述检测完成后，3 组大鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠处死，称量体重，将预冷的0.9%氯化钠注射液注入左心室，直至心脏变白，并用滤纸吸干水分。解剖并分别称量左、右心室，分别计算左心室重量指数（left ventricle weight index，LVWI）及右心室重量指数（right ventricle weight index，RVWI），计算方法为心室游离壁重量/体重。

1.2.5 组织病理学和胶原表达水平检测 采用4%甲醛固定心脏组织，石蜡包埋，切片。4 μm 厚切片，HE 和Masson 染色，使用光学显微镜（日本Nikon 公司，TS100型）拍摄图像，用Image Pro Plus 图像处理软件（美国Media Cybernetics 公司）分析测量蓝色纤维化面积和总面积。计算胶原体积分数（collagen volume fraction，CVF），CVF=蓝色纤维化面积/总面积×100%。每只大鼠取1 块100 mg 新鲜心肌组织，加入1 ml 的PBS（pH 7.4）中，匀浆后制作组织悬液，3 000 r/min 离心20 min，回收上清液，采用Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原（武汉云克隆公司，批号：SEA571Ra，SEA176Ra）ELISA 试剂盒检测胶原表达水平。

1.2.6 心肌组织EndMT 指标检测 每只大鼠心脏取新鲜心肌组织用放射免疫沉淀裂解缓冲液提取蛋白，采用Western blot 方法检测心肌组织蛋白表达水平。等量的蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳系统（美国Bio-Rad 公司）分离，转移到聚偏二氟乙烯膜后用5%脱脂奶粉封闭，然后用一抗在4 ℃下孵育过夜。EndMT表现为内皮标志物如分化簇31（cluster of differentiation 31，CD31）的表达水平降低，而间充质标志物如α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和波形蛋白的表达水平增加，故采用p53 一抗（美国CST 公司，批号：2524S），CD31 一抗（英国Abcam 公司，批号：ab28364），α-SMA 一抗（美国Proteintech 公司，批号：A5228），波形蛋白一抗（美国Proteintech 公司，批号：10366-1-AP）孵育过夜，次日用二抗在室温下孵育1 h，用凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad 公司Hercules 型）扫描蛋白条带，分析蛋白表达水平。采用免疫荧光染色对心肌组织染色，将心肌组织与CD31 一抗和α-SMA一抗置于4 ℃5%牛血清白蛋白中孵育过夜，染色次日在37 ℃下加入二抗孵育1 h。用PBS 洗涤数次，再用10 mg/ml 的4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）孵育5 min 以上进行细胞核染色。采用倒置荧光显微镜（日本Nikon 公司，TS100 型）拍摄图像，观察蛋白表达水平。

1.2.7 细胞EndMT 指标检测 将HMVECs 放在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，当细胞密度达到90% 以上时传代。传代后将细胞分为观察组、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）组和对照组3组。观察组和TGF-β 组细胞采用20 ng/ml TGF-β（美国派普泰克公司，批号：100-21）处理24 h，其中观察组细胞再采用100 μmol/L Pifithrin-α 处理48 h，TGF-β 组细胞继续培养48 h；对照组细胞正常培养78 h。3 组细胞用放射免疫沉淀裂解缓冲液提取蛋白。随后采用上述Western blot 方法检测3 组细胞p53、CD31、α-SMA 和波形蛋白等表达水平。采用上述免疫荧光染色的方法对3组细胞染色。

1.3 统计学处理 应用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠心功能指标比较 3组大鼠LVEDd、LVPWd 和EF 比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），3组大鼠心率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。ISO组大鼠LVEDd 高于对照组，LVPWd 和EF 低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察组大鼠LVEDd 低于ISO 组，LVPWd 高于ISO 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表1。

表1 3组大鼠心功能指标的比较

2.2 3 组大鼠血流动力学参数比较 3 组大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。ISO 组大鼠LVEDP 高于对照组，LVSP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察组大鼠LVEDP 低于ISO组，LVSP、+dp/dtmax 和-dp/dtmax 高于ISO 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 3组大鼠血流动力学参数的比较

2.3 3 组大鼠心脏重量指数的比较 3 组大鼠LVWI和RVWI 比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），3 组大鼠体重比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。ISO 组大鼠LVWI 和RVWI 高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察组大鼠LVWI 和RVWI 低于ISO组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

表3 3组大鼠心脏重量指数的比较

2.4 3 组大鼠病理形态学及胶原表达水平比较 ISO组大鼠胶原纤维增生、心肌细胞形态不规则及炎症细胞浸润，而观察组和对照组大鼠心肌纤维化较轻。3组大鼠CVF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。ISO 组大鼠CVF 高于对照组，观察组大鼠CVF 低于ISO 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。ISO 组大鼠Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平高于对照组，观察组大鼠Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平低于ISO 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图1（插页）。

图1 3 组大鼠大鼠病理形态镜下所见及胶原表达水平比较（A：3 组大鼠HE 染色检测心肌纤维化程度，×40；3 组大鼠HE 染色检测心肌纤维化程度，×200；C：3 组大鼠Masson 染色检测心肌纤维化程度，×40；D：3 组大鼠Masson 染色检测心肌纤维化程度，×200；E：3 组大鼠心肌组织CVF 比较；F：3 组大鼠心肌组织Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达水平比较）

2.5 3 组大鼠心肌组织EndMT 指标比较 3 组大鼠心肌组织CD31、α-SMA、波形蛋白和p53 表达水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。ISO 组大鼠心肌组织α-SMA、波形蛋白和p53 表达水平高于对照组，CD31 表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察组大鼠心肌组织α-SMA、波形蛋白和p53 表达水平低于ISO 组，CD31 表达水平高于ISO 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。免疫荧光染色检测ISO 组大鼠心肌组织α-SMA 表达水平较高，CD31 表达水平较低；观察组和对照组大鼠心肌组织α-SMA 表达水平较低，CD31 表达水平较高。见图2（插页）。

2.6 3 组细胞EndMT 指标的比较 3 组细胞CD31、α-SMA、波形蛋白和p53 表达水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。TGF-β 组细胞α-SMA、波形蛋白和p53 表达水平高于对照组，CD31 表达水平低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察组细胞α-SMA、波形蛋白和p53 表达水平低于TGF-β 组，CD31 表达水平高于TGF-β 组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。免疫荧光染色检测TGF-β 组细胞α-SMA 表达水平较高，CD31 表达水平较低；观察组和对照组细胞α-SMA 表达水平较低，CD31 表达水平较高。见图3（插页）。

图3 3 组细胞EndMT 指标比较（A：3 组细胞CD31、α-SMA、波形蛋白和p53 蛋白表达电泳图；B：3 组细胞CD31、α-SMA、波形蛋白和p53 蛋白表达水平比较；C：3 组细胞CD31 和α-SMA 表达水平）

3 讨论

心肌纤维化是各类心脏疾病的重要病理特征。研究证实，在终末期心力衰竭的患者心肌组织中，存在ECM 的大量堆积，表现为心肌纤维化。大量ECM堆积在心肌间质中，可恶化心功能和诱导心律失常的发生，最终发展为终末期心力衰竭[7]。因此，寻找有效的心肌纤维化治疗靶点，对延缓心力衰竭、降低病死率有重要临床意义。皮下注射ISO 是制备心肌纤维化动物模型的经典方法[8]。ISO 通过结合于β1-肾上腺素受体来加强心肌收缩力，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，诱导EndMT 和成纤维细胞激活，促进心肌纤维化的发生、发展[9]。

心肌纤维化过程包括成纤维细胞的增殖及其向肌成纤维细胞分化，而表达α-SMA 的肌成纤维细胞是分泌细胞间质ECM 蛋白的主要细胞[10-11]。目前研究发现，心肌成纤维细胞数量的增加可来源于多种细胞，如心肌原位成纤维细胞的增殖、循环中的巨噬细胞以及发生EndMT 的内皮细胞，而内皮细胞来源的成纤维细胞约占32%[12-13]。EndMT 是内皮细胞获得间充质细胞特征而失去内皮细胞特征的过程。在EndMT 过程中，内皮标志物如CD31 和钙黏蛋白的表达水平降低，而间充质标志物如α-SMA、成纤维细胞特异蛋白-1 和波形蛋白的表达水平增加[14]。发生EndMT 的内皮细胞在形态学上表现为细胞内蛋白骨架重排、细胞间黏附减少和伪足出现，并且细胞的迁移侵袭和增殖的能力增强[15]。研究证实，EndMT 促进心肌纤维化的发生、发展，而抑制EndMT 可减轻心肌纤维化，改善心功能[16]。本研究结果提示Pifithrin-α 抑制了异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌EndMT。

本研究通过动物和细胞实验发现，p53 在ISO 诱导的大鼠心肌纤维化模型和TGF-β 诱导的细胞EndMT过程中表达水平升高。p53 是最广为人知的肿瘤抑制基因，除了作为细胞衰老、细胞周期阻滞和凋亡的主要调节因子外[17-18]，p53 还参与控制多种生物学过程的基因的转录调控，如分化、迁移或血管生成[19-20]，在纤维化疾病中亦发挥重要影响[21]。p53 在正常细胞中表达水平较低，但当细胞受到低氧等应激后，p53 表达水平上调并被激活[22]。p53 可通过促进结缔组织生长因子的表达，诱导肝脏纤维化，而条件性敲除小鼠肝细胞p53 基因可减轻肝纤维化[23]。在输尿管梗阻小鼠模型中，p53 可通过诱导EndMT 促进肾纤维化[24]。p53 可与信号转导分子3（signal transduction molecule3，Smad3）相互作用，通过激活TGF-β1/Smad 信号通路启动EndMT，导致糖尿病心肌纤维化[25]。研究证实，p53在心力衰竭患者的心肌活检组织中表达水平升高，并且随着心力衰竭的恶化，p53 表达水平逐渐升高[26]。小鼠敲除p53 基因可减轻心肌损伤，而激活p53 可恶化左心室功能[27]。Pifithrin-α 是p53 抑制剂，可阻断其转录活性。本研究动物和细胞实验均提示，p53 可能是心肌纤维化的重要干预靶点；Pifithrin-α 可能通过抑制p53 介导的EndMT，减轻大鼠心肌纤维化。

综上所述，ISO 诱导的心肌纤维化大鼠模型p53 介导的EndMT 水平升高；Pifithrin-α 通过抑制p53 介导的EndMT，减轻心肌纤维化程度，靶向p53 介导的EndMT是心肌纤维化的潜在治疗方案。

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