PRiME HLB固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中的双酚A*

王玉梅，刘 真，姜 星

（南京市食品药品监督检验院，江苏 南京 211198）

化妆品包装除了可以美化外观外，还可以阻止化妆品内部与外界接触，起到抗氧化和防腐的作用［1］。目前，化妆品的包装材料的主要有玻璃、塑料、金属箔等，其中，塑料包装具有方便运输、耐冲击强度大等优点，已经成为化妆品常用的包装材料。双酚A（Bisphenol A，BPA）是用来合成聚碳酸酯、酚醛树脂和不饱和聚酯树脂等材料的重要物质［2］，主要用于塑料瓶，食品、化妆品包装的生产。但双酚A属于一种内分泌干扰物质，对人的内分泌、神经系统、生殖系统等有不良影响，严重时会诱发癌症［3］。我国《化妆品技术规范》（2015版）明确规定双酚A是化妆品中的禁用物质［4］，但相应的检测方法不完善。目前，化妆品中双酚A的检测标准仅有SN／T 3822-2014和GB／T 30939-2014，两者均使用氨基固相萃取小柱净化，前处理过程复杂，且采用外标法定量，存在基质干扰、定量不准确等现象，不能满足日常的监管检验需求。本研究针对水状、膏霜状和精油状三种性状化妆品基质中双酚A的残留量，采用氨化乙腈提取，通过PRiME HLB固相萃取小柱净化后，采用高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中双酚A，内标法定量，提取净化方法灵敏快捷，以期为化妆品的监管提供技术保障。

1 试验部分

1.1 材料、试剂与仪器

双酚A（100.2μg／mL）、双酚A-d4（100.0 μg／mL），天津阿尔塔科技有限公司；Oasis PRIME HLB固相萃取小柱，200mg／6mL，美国Waters公司；甲醇、乙腈、氨水，色谱级，德国Merck公司；甲酸、氟化铵，色谱级，上海阿拉丁生化科技股份公司；实验用水为市购蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

Agilent 6470三重四极杆液质联用仪 （配ESI源），美国安捷伦科技有限公司；Waters ACQUITY UPLC BEH C18，Waters公司；VISIPREP 24TM DL固相萃取装置，Supelco公司；Sorvall LYNX 4000高速离心机，美国赛默飞世尔科技公司；MV5浓缩氮吹仪，莱伯泰科有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

①提取：称取0.5 g试样（精确至0.001 g）于10mL具塞比色管中，加入50μL双酚A-d4标准中间液，加入少量5%氨水-乙腈溶液充分混匀后定容至刻度，超声提取15min后转移至离心管中，10000 r／min离心5 min，取上清液备用。

②净化：取全部上清液，过PRiME HLB固相萃取小柱，收集净化液，40℃水浴中氮气吹至近干，用甲醇溶解并定容至1.0mL，过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

1.2.2 液相色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100mm×Ø2.0mm，1.7μm）；流速：0.4mL／min；柱温：35℃；进样量：5μL；流动相：A（甲醇）、B（0.1%氟化铵水溶液）；梯度洗脱程序为0～2.5min，40%～90%A；2.5～4.6min，90%A；4.6～7.0min，90%～95%A；7.0～7.5min，95%A；7.5～7.6min，95%～40%A；7.6～10.0min，40%A。

1.2.3 质谱条件

离子源：电喷雾（ESI）离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：MRM多反应监测；干燥气温度：300℃；干燥气流速：12 L／min；雾化气压力：275.8 kPa；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11 L／min；毛细管电压：3500 V；双酚A及其内标双酚A-d4的保留时间、离子对、碰撞电压和裂解电压见表1。

表1 双酚A及其内标的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱质谱条件的优化

参照相关文献［5］，色谱柱选用常规的适合小分子类物质分离的Waters ACQUITY UPLC BEH C18（Ø2.1mm×50mm，1.7μm）。实验首先考察了0.1%甲酸溶液-甲醇、水-甲醇和0.1%氨水溶液-甲醇三种流动相体系，结果表明，当使用0.1%甲酸溶液-甲醇流动相体系时，双酚A的相应较弱；使用0.1%氨水溶液-甲醇流动相体系时；双酚A的出峰时间较早，响应也相对较弱，而使用水-甲醇流动相体系时双酚A的响应强度较高，色谱峰形较好。为了使双酚A的响应强度更高，故于流动相中添加0.1%氟化铵，结合前处理步骤中采用甲醇作为定容溶剂，因此本实验确定流动相为0.1%氟化铵水溶液-甲醇。

实验进利用Agilent三重四极杆液质联用仪自带的Masshunter Optimizer软件分析双酚A及其内标的标准溶液，获得目标物质的母离子、子离子及对应的碰撞能和裂解电压。

2.2 提取溶剂的优化

本研究首先对比了乙腈和甲醇的作为提取溶剂的效果，结果表明，在水状、膏霜状、精油状三种性状化妆品基质中，乙腈的提取效率均优于甲醇，回收率均在80%上，故选择乙腈作为提取溶剂。在此基础上，实验考察了1%甲酸乙腈溶液、乙腈和1%氨水乙腈溶液的提取效率，具体结果见图1。实验表明在乙腈中加入氨水后可以增强提取效果。

图1 使用不同提取溶剂对提取效率的影响

实验进一步研究了1%、2%、5%、8%、10%、15%氨水乙腈溶液的提取效果，结果见图2。发现使用5%和8%的氨水乙腈溶液时，三种不同性状基质中双酚A的提取率都比较高。考虑到前处理过程中有氮吹的步骤，实验确定采用5%氨水乙腈溶液作为提取溶液，三种不同形状基质中提取效率均达到95%以上。

图2 不同体积分数的氨水乙腈对提取效率的影响

实验进一步研究了化妆品基质的超声时间的最优条件，于三种性状的化妆品基质中加入20 ng双酚A标准溶液，分别超声5、10、15、20、25min。结果表明，超声时间15min后三种不同性状基质中双酚A的提取率均大于90%以上，且提取效率保持恒定水平。

2.3 定量方式的选择及基质效应的考察

采用质谱分析时需考虑基质效应的影响，一般采用基质效应（ME）＝（1-基质匹配标准曲线的斜率／溶剂标准曲线的斜率）×100%的计算方法来评价的基质效应，基质效应在±20%内不显著，结果为正时表示基质抑制，为负表明基质增强［6］。

测定化妆品中的双酚A的相关标准及文献中大部分采用外标法定量，但是实际实验中发现采用外标法定量时受化妆品基质干扰较大，尤其是精油状化妆品，基质效应明显，测定的回收率＜50%，结果定量产生的误差较大。本研究改用双酚A-d4内标法定量，内标峰形较好，基线噪音小，无干扰峰，保留时间与双酚A接近。

本实验进一步考察了水状、膏霜状和精油状三种性状化妆品基质于线性范围2～50 ng／mL的基质效应，结果见表2。双酚A在三种基质中基质效应均不明显，进一步说明引入同位素内标后，双酚A的基质效应得到了很好的改善。

表2 双酚A的基质标准曲线、相关系数、定量限及基质效应

2.4 净化方式的优化

化妆品基质复杂，一般由油脂、乳化剂等成分组成，膏霜状和精油状化妆品基质提取后会出现浑浊难离心的状况［7］，需要净化后才能上机分析，否则会污染离子源，影响目标物的响应。

根据双酚A的相关报道［8］，本实验分别考察C18、PRIME HLB、MAX、氨基固相萃取小柱的吸附效果。结果发现，采用C18柱净化时，三种基质中的双酚A的回收率都比较低，使用MAX、氨基固相萃取小柱和PRIME HLB固相萃取柱时，双酚A的回收率均能大于80%，但由于使用MAX和氨基固相萃取小柱时需要活化、洗脱等繁杂的实验步骤，考虑到实验的快速和便捷性，PRIME HLB不需要活化等前处理步骤，操作相对简单，因此本实验最终选择PRIME HLB固相萃取小柱作为净化柱。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性范围和检出限

在本研究方法确定的前处理及分析条件下，对水状、膏霜状和精油状三种性状化妆品基质中的双酚A的线性范围进行测定，以质量浓度为横坐标，双酚A的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，并得到相关系数。双酚A在2 ng／mL～50 ng／mL的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均＞0.99。具体结果见表2。

2.5.2 精密度与回收率实验

于水状、膏霜状、精油状三种性状化妆品空白基质中，按照定量限的1倍、2倍和10倍定量限的质量浓度水平添加双酚A，进行加标回收率实验。各质量浓度水平均做6个平行，计算双酚A的回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表3。由表3可知，水状化妆品基质中的双酚A 的平均回收率为95.6% ～101.2%，相对偏差小于3.2%；膏霜状化妆品基质中的双酚A的平均回收率为93.2%～98.8%，相对偏差小于4.2%；精油状化妆品基质中的双酚A的平均回收率为92.5%～99.0%，相对偏差小于3.9%。

表3 双酚A的回收率和相对标准偏差 （n＝6）

2.6 实际样品测定

实验采用建立的方法进行实际样品的检测，分别测定了90批次的样品，包括水状、膏霜状和精油状化妆品各30批。通过保留时间、离子丰度比等信息进行判定，以上样品中均未检出双酚A；样品图谱中无杂质干扰峰，内标出峰正常。可能是因为所检的化妆品均是品牌厂家生产的，具有良好的质量保证。

3 结论

本实验建立了PRiME HLB固相萃取-高效液相-串联质谱法测定水状、膏霜状和精油状三种化妆品基质中的双酚A残留量。本方法前处理快捷简便，定量准确可靠，检测灵敏度和精密度较好，为化妆品的监管和风险监测提供了有力的技术支撑。