哈茨木霉对商洛烟区植烟土壤细菌多样性的影响

穆耀辉　任志超　李淑娥　张永峰　任天宝　张松涛　姬小明　王景　殷全玉　刘国顺

摘要：探究哈茨木霉对植烟土壤细菌多样性与群落结构的影响，为优化轮作烟草根际土壤的细菌群落结构、物种组成及土壤的可持续发展奠定了一定的基础。采用大田试验方法，设置CK（常规施肥）和T1（常规施肥+哈茨木霉菌剂7.5 kg/hm2）2个处理，通过高通量测序技术探究施用哈茨木霉对各处理土壤细菌多样性、菌落结构及理化指标的影响。结果表明，哈茨木霉菌剂的施用降低了土壤细菌群落结构的α多样性指数，与常规施肥相比，增加了放线菌门（11.06％）的丰度，减少了变形菌门（4.03％）、绿弯菌门（2.28％）及酸杆菌门（1.71％）的丰度，土壤全氮和速效钾含量显著提高，分别提高14.2％和37.1％。表明在植烟土壤中施加哈茨木霉菌肥可进一步优化植烟土壤细菌群落结构，提高土壤肥力。

关键词：木霉；根际土壤；细菌群落；多样性；土壤理化性质；高通量测序

中图分类号S154.3文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）06-0152-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.037

Effects of Trichoderma harzianum on Bacterial Diversity in Tobacco Growing Soil in Shangluo Tobacco Area

MU Yaohui1，REN Zhichao2，LI Shue1  et al

（1.Shangluo Company of Shaanxi Tobacco Company，Shangluo，Shaanxi  726000;2.Tobacco College of Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan  450000）

AbstractThe effects of Trichoderma harzianum on bacterial diversity and community structure in tobaccoplanting soil were studied，which laid a foundation for optimizing the bacterial community structure，species composition and sustainable development of soil in tobacco rhizosphere soil.A field experiment was conducted to investigate the effects of Trichoderma harzianum on soil bacterial diversity，colony structure and physical and chemical indexes by using highthroughput sequencing technology in CK （conventional fertilization） and T1 （conventional fertilization+Trichoderma harzianum 7.5 kg/hm2）.The application of Trichoderma harzianum decreased the α diversity index of soil bacterial community structure.Compared with conventional fertilization，Trichoderma harzianum increased the abundance of Actinobacteriota （11.06%），decreased the abundance of Proteobacteria （4.03%），Chloroflexi （2.28%） and Acidobacterioa （1.71%），and significantly increased soil total nitrogen and available potassium content by 14.2% and 37.1%，respectively.Studies have shown that the application of Trichoderma harzianum fertilizer in tobaccogrowing soil can further optimize the bacterial community structure in tobaccogrowing soil and improve soil fertility.

Key wordsTrichoderma;Rhizosphere soil;Bacterial community;Diversity;Soil physicochemical properties;Highthroughput sequencing

植物從土壤中汲取养分来完成各种生命活动，意味着土壤是影响甚至决定植物生长发育状况的重要因素，但土壤本身必须发育到一定程度才能满足植物的生长发育需要［1］。土壤微生物作为植物与土壤的桥梁，有促进土壤养分循环、净化土壤污染、调节土壤生态系统稳定等作用［2-5］。人们通过研究土壤微生物的功能多样性、群落结构及物种种类多样性来阐释土壤生态系统与土壤微生物的关系。由于作物多年连作，生产管理措施不当导致土壤营养流失、土壤微生物群落结构破坏、烟草植株发育不良等，成为制约我国烟草行业发展的重要因素。

木霉是自然界中的一类有益生防菌，据统计，木霉对18个属30种的植物病原菌具有良好的生防效果，且具有分布广、适应性强及繁殖快等特点［6-8］，不仅对多种植物病原菌具有拮抗作用，还可以改善作物根际土壤微生物群落结构［9-10］。张丽荣等［11］在西瓜根际土壤中施加木霉制剂可显著提高土壤中有益微生物的含量，有效改善了土壤根际微生态效应。刘正洋等［12］通过施用木霉生物有机肥发现土壤微生物群落结构和组成发生改变，白菜-甘蓝连作体系产量明显提高。扈进冬等［13］通过对小麦与哈茨木霉拌种处理发现土壤中病原真菌的相对丰度显著降低。王义坤等［14］通过在连作土壤中施加哈茨木霉发现土壤根系酶活性及活力明显提高，土壤镰孢菌丰度显著降低，对苹果连作障碍的防控具有良好效果。目前，木霉在小麦、香蕉、棉花等［15-17］土壤微生物多样性方面的研究已有不少报道，而对于烟草土壤微生物多样性方面的研究鲜见报道。鉴于此，笔者通过高通量测序的方法对施用哈茨木霉菌剂及未施用哈茨木霉菌剂烟株的土壤微生物群落结构及多样性进行分析，探究哈茨木霉菌剂对商洛市植烟土壤微生物多样性的影响，对烟草的生长发育及土壤的可持续发展具有重大意义。

1材料与方法

1.1试验材料供试烟草品种为云烟99，供试土壤类型为黏壤土，取自陕西省商洛市洛南县，哈茨木霉Z-19菌剂由河南农业大学烟草科教园区微生物实验室制备、保存。

1.2试验设计采用随机区组排列方法，设2个处理，重复5次。

处理①常规施肥；处理②常规施肥+哈茨木霉菌剂7.5 kg/hm2；常规施肥为烟草专用肥（N∶P∶K=12∶10∶23）7.5 kg/hm2+蚯蚓粪1 t/hm2+西洋复合肥（N∶P∶K=16∶6∶23）150 kg/hm2。

试验于2020年2—10月在陕西省商洛市洛南县进行，试验田地势平坦，排灌方便。所用哈茨木霉菌剂的质量要求为活菌数≥20亿mL，移栽时使用，与移栽水混匀后灌根即可。

1.3土壤取样

在烟草移栽75 d时，避开雨天和过度干旱期。取样方法参照文献［18］，按照5点取样法在每个处理选取10个取样点，即每个重复2个取样点，利用铲子将烟株周围10 cm的土壤挖至30 cm深，切割土壤中烟株的任何侧根并挖出烟株的整个根部放于盆中，摇动根部用铲子从根部去除土壤，采集2份盆中的土壤，一部分除去各种杂质后混匀过2 mm筛并取5 g于10 mL无菌离心管中直接干冰运送到上海美吉生物医药科技有限公司进行土壤微生物多樣性检测，剩余部分土壤放于密封袋内快速运回实验室-80 ℃保存并进行理化性质分析。

1.4土壤理化性质分析

测定方法参照文献［19］，土壤全氮、全碳用全自动CN分析仪（vario MAX CN，德国）测定;硝态氮和铵态氮用全自动化学分析仪（Smartchem140，意大利）测定;土壤pH用电位法测定;速效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定;速效钾采用1 mol/L乙酸铵浸提-火焰光度计法测定。

1.5土壤微生物测定分析方法

使用土壤基因组DNA快速抽提试剂盒对土壤微生物群落进行DNA的提取，并利用上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。测序流程分为PCR扩增、PCR产物的混样与纯化、文库的构建3部分。对细菌V3～V4可变区进行PCR扩增，其引物为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。扩增程序：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），之后72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃保存。

1.6数据分析采用 DPS 7.0 软件分析处理数据，用R语言工具制图。

2结果与分析

2.1哈茨木霉菌剂对土壤化学性质的影响由表1可知，与CK相比，T1土壤的全碳、铵态氮和速效磷含量分别提高了10.8％、3.3％、2.1％且不存在显著差异，T1土壤的全氮、硝态氮及速效钾含量分别提高了16.7％、91.3％、59.0％且与CK存在显著差异。说明哈茨木霉菌剂的施用可显著提高土壤全氮、硝态氮及速效钾的含量，虽未显著提高土壤全碳、铵态氮和速效磷的含量，但也稍有提高。

2.2哈茨木霉菌剂对土壤微生物群落结构的影响

2.2.1样本测序结果。

Veen图表示土壤样本中的相同物种及差异物种，抽平后检测到土壤样本的微生物总OTUs数为2 293。由图1可知，CK和T1共有的OTUs总数为1 958，各处理所含的特有OTUs总数分别为171和164，分别占土壤样本OTUs总数2 293的7.46％和7.15％。总体来看，施加哈茨木霉后烟株根际土壤的 OTUs 总数比未施加哈茨木霉的有所降低。

稀释曲线在细菌群落结构多样性的调查中常用来分析所取样本量是否足够及估计样本群落结构的丰富度。即随机抽取一定数量的序列作为横坐标，α多样性指数值为纵坐标，通过观察曲线的平稳程度来判断序列数量是否符合该试验。随着土壤样品量的增加，可能出现测序检测到的物种种类随之增加的状况，由图2可知，当序列数达5 000时，各土壤样本曲线均居于平缓，并不随着土壤样本量的加大而显著增加，说明土壤样本细菌的总DNA测序深度足够，细菌群落结构置信度高，此次分析结果可靠。

2.2.2土壤细菌群落的α多样性。

α多样性指数分析是通过一些统计学指数来分析并评估细菌群落结构的丰度与多样性，Coverage指数用来描述样本菌落的覆盖率，即该次测序是否代表真实状况，Chao1指数反映了细菌群落结构的丰度，Shannon指数和Simpson指数反映了细菌群落结构的均匀性。由表2可知，各个样本细菌的Coverage均接近100％，表明此次测序反映了细菌群落结构的真实性。Chao指数和Shannon指数表现为CK＞T1，而Simpson指数与之相反，由此可知，哈茨木霉的施用降低了植烟土壤群落结构的丰度和均匀性；从细菌群落结构的丰度来看，虽然CK和T1处理的Chao1指数不存在显著差异，但数值上还是出现了差距，即降低了8.0％，施用哈茨木霉的土壤群落结构丰度要小于常规施肥的土壤群落结构丰度；从细菌群落结构的均匀性来看，各处理的Shannon指数和Simpson指数存在显著差异且施用哈茨木霉的土壤群落结构均匀性显著小于常规施肥的土壤群落结构均匀性，Shannon指数降低了11.8％，Simpson指数增加了258.8％，说明哈茨木霉菌剂的施用影响了土壤微生物群落结构。

2.2.3土壤细菌群落结构组成。

与Silva数据库进行比对后，可以得到土壤样本细菌在门水平下Top10的物种分布图。由图3可知，施用哈茨木霉的土壤与常规施肥的土壤群落结构在门水平上基本一致，但相对百分比存在差异。相对丰度较高的放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）及酸杆菌门（Acidobacteriota）为2个土壤样本的优势物种，相对丰度达80％以上。放线菌门（Actinobacteriota）在施用哈茨木霉的土壤样本中的相

对含量高于常规施肥的土壤样本，分别为42.43％和53.29％，提高了10.86百分点；对于变形菌门（Proteobacteria），T1处理相比CK处理的相对丰度明显降低了4.03％；各个处理绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteriota）的相对丰度表现为T1＞CK，T1处理的相对丰度相比CK处理分别降低了2.28％和1.71％。

Heatmap图根据土壤样本间丰度进行分块聚类，通过颜色的变化来反映土壤样本在不同水平上的相关性，红色越深说明在该水平上土壤细菌生长所受到的促进作用越强，相对丰度也随之越高，蓝色越深说明在该水平上土壤细菌生长所受到的促进作用越弱，相对丰度也随之越低。由图4可知，CK处理对变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）及酸杆菌门（Acidobacteriota）的促进作用比T1处理有所增强，对放线菌门（Actinobacteriota）的促进作用比T1处理有所减弱。

2.2.4土壤细菌群落主成分分析。

PCoA分析是一种非约束性的数据降维分析方法，用来分析土壤样本群落组成的相关性，如果在PCoA图中的距离越近，则土壤样本的物种组成越相似。由图5可知，PC1 和 PC2 解釋率分别为69.67％和12.53％，CK处理主要集中在坐标轴左侧，T1处理主要集中在坐标轴右侧，说明2组土壤样本的细菌群落结构组成差异较大。由图6可知，在 PC1 轴上 CK和T1处理之间的距离较近，说明哈茨木霉的施用改变了土壤细菌群落结构；CK和T1处理之间的箱形长度无明显差异，说明2个处理的重复性一致。

2.2.5土壤细菌群落LEfSe分析。

LEfSe根据分类学组成对样本按照不同的分组条件进行线性判别分析（LDA），以此找出对样本划分产生显著性差异影响的群落或物种。对CK和T2组土壤样本进行LEfSe多级物种差异判别分析来检测具有显著差异的微生物，并采用LDA线性判断分析来评估每个物种对差异效果影响的程度。由图7可知，在CK土壤样本中，变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、Sumerlaeota、Abditibacteriota及Bdellovibrionota显著富集；在T1土壤样本中，放线菌门（Actinobacteriota）、Dependentiae及脱硫菌门（Desulfobacterota）发生显著富集。由图8可知，变形菌门（Proteobacteria）对CK组土壤的群落结构影响最大，而放线菌门（Actinobacteriota）对T1组的土壤群落结构影响最大。

2.2.6优势菌门与土壤化学指标的相关性分析。优势菌门与土壤化学指标的相关系数用来表明环境因子与物种之间的相关程度，挑选相对丰度前10的物种与土壤理化指标进行相关性分析，结果见表3。由表3可知，放线菌门与全氮和速效钾的正相关程度最明显为0.38；变形菌门与速效钾的负相关程度最明显为-0.62；绿弯菌门和酸杆菌门与铵态氮的负相关程度最明显分别为-0.60和-0.67。

3讨论

土壤细菌的物种多样性指数可反映土壤细菌群落结构的丰富度和多样性［20］。该研究结果发现，施用哈茨木霉菌剂的土壤样本的Shannon指数和Simpson指数均存在显著差异，Chao1指数不存在显著差异，但数值上还是出现了差距，说明哈茨木霉菌剂的施用降低了土壤细菌群落的丰富度和多样性。从土壤细菌群落结构的组成可以看出，施用哈茨木霉的土壤与常规施肥的土壤群落结构在门水平上基本一致，相对丰度较高的放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）及酸杆菌门（Acidobacterioa）为2个土壤样本的优势物种，这与杨菁等［21］研究结果一致。放线菌是一类抗生素生产菌，通过寄生于植物体内来让植物产生抑菌物质，从而提高植物的抗病性［22］。同时，放线菌门常以孢子形态共存于土壤之中，对植物供给养分，促进植物生长发育［23］。该研究表明，施用哈茨木霉会导致土壤肥力不同程度的提高，其中施用哈茨木霉的土壤中放线菌门（Actinobacteriota）的相对丰度显著提高，通过分析表明放线菌门（Actinobacteriota）与土壤全氮和速效钾的含量呈正相关关系，从而导致土壤全氮和速效钾含量的显著提高；放线菌门（Actinobacteriota）会产生抑菌物质来提高烟株的抗病性且供给更多的养分来促进烟株生长发育。变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）及酸杆菌门（Acidobacteriota）在土壤群落结构中相对丰度减少可能是因为放线菌门（Actinobacteriota）相对丰度的增加导致土壤中部分养分被竞争，从而相对丰度减少［24］。施用哈茨木霉也会使其他土壤肥力指标的含量不同程度的增加，这是因为施用哈茨木霉可促进土壤中有机质的形成与转化从而提高土壤肥力［25］。

4结论

该研究结果表明，施用哈茨木霉菌剂可显著改变土壤的细菌群落结构，施加哈茨木霉后植烟土壤细菌群落物种多样性降低，在门水平上的优势菌群中放线菌门（Actinobacteriota）的含量显著增加，变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）及酸杆菌门（Acidobacteriota）的含量降低，土壤全氮和速效钾含量显著提高。哈茨木霉的施用优化了植烟土壤的细菌群落结构，提高了土壤肥力。研究结果揭示了哈茨木霉菌剂对商洛市植烟土壤微生物多样性的影响，这为优化轮作烟草根际土壤的细菌群落结构、细菌群落物种组成及土壤的可持续发展奠定了一定的基础。

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基金项目中国烟草总公司陕西省公司科技项目（2021611000270042）。

作者简介穆耀辉（1970—），男，陕西商洛人，高级农艺师，硕士，从事烟草生产管理技术研究。*通信作者，副教授，博士，从事烟草资源微生物利用与土壤保育研究。

收稿日期2022-05-16