雷公藤甲素对人结直肠癌细胞奥沙利铂耐药性的影响

熊万成，平贯芳，贺德栋，陈发帅，赫 鹏

(1.新乡医学院第一附属医院普外科,河南 卫辉 453100;2.新乡医学院第一附属医院药学部,河南 卫辉 453100)

结直肠癌是全球范围内一种常见的消化道恶性肿瘤。2020年,全球结直肠癌发病人数占所有癌症人数的9.3%,成为仅次于肺癌和肝癌的第三大常见癌症[1]。中国结直肠癌发病、死亡趋势与全球趋势一致,但由于中国人口基数大,导致结直肠癌发病人数、死亡人数占全球结直肠癌发病人数、死亡人数的比例较高(分别为28.8%和 30.6%)[2]。尽管化学治疗和化学治疗联合放射治疗在结直肠癌患者中取得了一定的治疗效果,但患者对化学治疗药物的耐药仍是导致临床预后不良的主要原因[3]。近年来,针对中医药研究的快速发展为耐药性结直肠癌的治疗提供了新的思路[4]。雷公藤甲素(triptolide,TPL)是中药雷公藤的主要活性成分,具有抗炎、免疫抑制、心脏保护和抗骨质疏松等多种药理功效。有研究证实,雷公藤在前列腺癌、卵巢癌、肝癌、肺癌以及结直肠癌等多种癌症中发挥抗肿瘤作用,并能够逆转肿瘤细胞对化学治疗的耐药性[5-25]。但TPL对结直肠癌细胞耐药的逆转作用鲜有报道,基于此,本研究通过构建结直肠癌耐药细胞系,探讨TPL对结直肠癌细胞耐药性的逆转作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂与仪器

人结直肠癌细胞系LoVo由联勤保障部队第九八九医院中心实验室惠赠;TPL购自北京索莱宝科技有限公司,TRIzol溶液、cDNA合成试剂盒购自美国Invitrogen公司,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、细胞周期检测试剂盒以及人膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V·fluorescein isothiocyanate,Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)荧光双染细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司,达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium,DMEM)购自美国Hyclone公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自浙江天杭生物科技股份有限公司,奥沙利铂(oxaliplatin,Oxa)购自恒瑞医药股份有限公司,免疫印迹配胶试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司,一抗、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的IgG二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;Transwell小室购自美国Corning公司,倒置显微镜购自德国Leica公司,恒温培养箱购自上海赛默飞世尔科技有限公司,全自动酶标仪购自美国Bio-rad公司,流式细胞仪购自美国碧迪生物科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 浓度梯度递增法构建结直肠癌耐药细胞系LoVo/Oxa

参照文献[26]中的方法构建结直肠癌耐药细胞系LoVo/Oxa。取LoVo细胞接种于含体积分数10% FBS的DMEM中,在培养液中持续加入不同浓度的Oxa。Oxa的起始浓度为0.1 μmol ·L-1,传3代后浓度逐渐提高为0.2、0.5、1.0、2.0 μmol ·L-1。取最终在Oxa浓度为2.0 μmol ·L-1的培养液中稳定传代生长的细胞为结直肠癌耐药细胞系LoVo/Oxa。

1.2.2 细胞培养及传代

将结直肠癌细胞系LoVo及LoVo/Oxa细胞分别接种于含体积分数10% FBS、100×103U·L-1青霉素和100 g·L-1链霉素的DMEM中,于37 ℃、饱和湿度、含体积分数5%CO2培养箱中培养。每2～3 d换液1次,待细胞生长至融合度达到 70%～80%后,用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化细胞3 min,再用完全培养基终止消化,收集脱壁细胞至15 mL无菌离心管中,800 r·min-1离心3 min(离心半径10 cm),弃上清,重悬细胞进行传代。

1.2.3 TPL对LoVo、LoVo/Oxa细胞无毒剂量的确定

将传代培养的LoVo及LoVo/Oxa细胞分别消化、计数,制成浓度为1×108L-1的细胞悬液,接种至96孔细胞培养板中,置于培养箱中培养24 h。将TPL用完全培养基稀释至浓度为12.0、6.0、3.0、1.5 g·L-1,每个浓度点设置6个复孔,并设只有培养基没有细胞的调零孔和只培养细胞不加药的空白对照孔。每孔加入100 μL TPL继续培养48 h后,按照CCK-8试剂盒的说明书步骤进行染色,用5 g·L-1CCK-8工作液37 ℃孵育待测细胞2 h后用酶标仪测波长450 nm处吸光度值,并计算细胞抑制率。细胞抑制率=(空白对照孔吸光度值-加药孔吸光度值)/(空白对照孔吸光度值-调零孔吸光度值)×100%,实验重复3次,取均值。应用GraphPad Prism 8.0软件根据抑制率绘制拟合曲线,取TPL作用24 h后LoVo、LoVo/Oxa 2组细胞抑制率 5%对应的浓度为逆转耐药的无毒剂量[27]。

1.2.4 CCK-8法检测细胞的耐药性及TPL处理后的细胞增殖能力

将传代培养的LoVo及LoVo/Oxa细胞分别消化、计数,制成浓度为1×108L-1的细胞悬液,接种至96孔细胞培养板中,放入37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中培养,细胞贴壁后分为LoVo组、LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组,LoVo组、LoVo/Oxa组细胞常规培养,LoVo/Oxa+TPL组细胞加入无毒剂量的TPL。用不同浓度(0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 mol·L-1)的Oxa处理3组细胞 48 h 后,每组每个浓度点设置6个复孔,按照CCK-8说明书步骤进行染色,37 ℃孵育2 h后用酶标仪测波长450 nm处吸光度值。实验重复3次,取均值。用GraphPad Prism 8.0软件根据抑制率绘制拟合曲线,并分别计算3组细胞的半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。

将传代培养的LoVo/Oxa细胞消化、计数,制成浓度为1×108L-1的细胞悬液,接种至96孔细胞培养板中,放入37 ℃、含体积分数5% CO2的培养箱中培养,细胞贴壁后分为LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组,LoVo/Oxa组细胞常规培养,LoVo/Oxa+TPL组细胞加入无毒剂量的TPL。分别于干预0、24、48、72、96 h时按照CCK-8说明书步骤进行染色,37 ℃孵育2 h后用酶标仪测波长450 nm处的吸光度值,以吸光度值代表细胞增殖能力。每组每个时间点设6个复孔,实验重复3次,取均值。

1.2.5 克隆形成实验检测TPL对 LoVo/Oxa细胞增殖能力的影响

取传代培养的LoVo/Oxa细胞,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后,以每孔 200 个接种于6孔细胞培养板中,每组设3个复孔。放入37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中培养,细胞贴壁后分为LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组,LoVo/Oxa组细胞常规培养,LoVo/Oxa+TPL组细胞加入无毒剂量的TPL。每 2 d 更换培养基,连续培养14 d,培养板中即可出现肉眼可见的克隆。各孔细胞先用多聚甲醛固定,磷酸盐缓冲液清洗后用结晶紫溶液染色。拍照并计数各孔细胞克隆数。实验重复3次,取均值。

1.2.6 流式细胞术检测TPL对 LoVo/Oxa细胞周期的影响

取传代培养的LoVo/Oxa细胞,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后,以每孔1×105个细胞接种至6孔细胞培养板中,每组设5个复孔。放入37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中培养,细胞贴壁后分别为LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组。LoVo/Oxa组细胞常规培养,LoVo/Oxa+TPL组细胞加入无毒剂量的TPL培养48 h后,消化、收集上述细胞。在待测细胞中加入体积分数70%的乙醇固定2 h,800 r·min-1离心3 min(离心半径10 cm),弃上清液,磷酸盐缓冲液重悬清洗后再次离心弃上清液,加入 10 μL PI避光作用15 min,再加入 400 μL 1×上样缓冲液,用流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次,取均值。

1.2.7 流式细胞术检测TPL对 LoVo/Oxa细胞凋亡的影响

取传代培养的LoVo/Oxa细胞,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后,以每孔1×105个细胞接种至6孔细胞培养板中,每组设5个复孔。放入37 ℃、含体积分数5%CO2的培养箱中培养,细胞贴壁后分别为LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组,LoVo/Oxa组细胞常规培养,LoVo/Oxa+TPL组细胞加入无毒剂量的TPL培养48 h后,消化、收集上述细胞。在待测细胞中加入 5 μL Annexin V-FITC染色液和 5 μL PI染色液,避光染色 15 min后,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次,取均值。

1.2.8 Transwell实验检测TPL对 LoVo/Oxa细胞迁移和侵袭能力的影响

将Transwell小室置于24孔板上,在Transwell小室中加入 200 μL 无血清培养基稀释的细胞悬液(1×104个LoVo/Oxa细胞),在24孔板中加入 600 μL 含有体积分数10%FBS的完全培养基,细胞贴壁后分别为LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组,LoVo/Oxa组细胞常规培养,LoVo/Oxa+TPL组细胞加入无毒剂量的TPL培养48 h后,用棉签擦拭掉小室底膜上层细胞,对小室底膜下层细胞进行结晶紫染色。染色完成后,随机选取5个视野进行显微镜拍照计数,5个视野分别计数迁移细胞数后求均值,迁移细胞数越多表示细胞迁移能力越强。

将铺好 Matrigel 基质胶的Transwell小室置于24孔板上,在Transwell小室中加入 200 μL 无血清培养基稀释的细胞悬液(1×104个LoVo/Oxa细胞),在24孔板中加入600 μL含有体积分数10%FBS的完全培养基,细胞贴壁后分别为LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组,LoVo/Oxa组细胞正常培养,LoVo/Oxa+TPL组细胞加入无毒剂量的TPL培养48 h后,用棉签擦拭掉小室底膜上层细胞,对小室底膜下层细胞进行结晶紫染色。染色完成后,随机选取5个视野进行显微镜拍照计数,5个视野分别计数侵袭细胞数后求均值,侵袭细胞数越多表示细胞侵袭能力越强。实验重复3次,取均值。

1.2.9 免疫印迹法检测TPL对 LoVo/Oxa细胞中蛋白表达的影响

取传代培养的LoVo/Oxa细胞,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化后,以每孔1×105个细胞接种至6孔细胞培养板中,细胞贴壁后分别为LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组,LoVo/Oxa组细胞正常培养,LoVo/Oxa+TPL组细胞加入无毒剂量的TPL培养48 h后,每组设3个复孔。2组细胞裂解后提取总蛋白,对蛋白进行定量后,每孔上样50 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,上样后低压80 V电泳30 min,高压120 V电泳 120 min,湿法转膜,50 g·L-1脱脂奶粉封闭结合位点1 h;转膜封闭后,滴加细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb) 易感基因、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance 1,MDR1)、P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)、Bcl-2基因相关的X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine-containing aspartate-specific protease-3,caspase-3)、剪切型冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteine-containing aspartate-specific protease-3,Cl-caspase-3)、波形蛋白(Vimentin)、上皮细胞钙黏附蛋白(epithelia-cadherin,E-cad)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2和MMP-9 一抗(滴度均为1：1 000),4 ℃过夜孵育,清洗3次后,用 HRP 标记的山羊抗小鼠二抗在室温条件下孵育1 h,清洗3次后,在暗室中用超敏发光液进行X光显影,采用凝胶成像分析系统扫描条带的灰度值。Cyclin D1、Rb、MDR1、P-gp、Bax、Bcl-2、caspase-3、Cl-caspase-3、Vimentin、E-cad、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量以其条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 TPL对LoVo和LoVo/Oxa细胞的抑制作用比较

6.0、3.0、1.5 μg·L-1的TPL对LoVo和LoVo/Oxa组细胞的抑制率比较差异无统计学意义(t=1.329,P>0.05);12.0 μg·L-1的TPL对LoVo组细胞的抑制率显著高于LoVo/Oxa细胞,差异有统计学意义(t=3.129,P<0.05)(表1)。经线性拟合,TPL对LoVo/Oxa细胞5%抑制率浓度为6.21 μg·L-1。

表1 LoVo组与LoVo/Oxa组细胞的抑制率比较Tab.1 Comparison of inhibition rate of cells between the LoVo group and LoVo/Oxa group

2.2 LoVo组、LoVo/Oxa组、LoVo/Oxa+TPL组细胞的耐药性比较

Oxa对LoVo、LoVo/Oxa、LoVo/Oxa+TPL组细胞的IC50分别为18.86、68.54、25.46 μmol·L-1,Oxa对LoVo/Oxa组细胞的IC50显著高于LoVo细胞,差异有统计学意义(t=-65.370,P<0.01);Oxa对LoVo/Oxa+TPL组细胞的IC50显著低于LoVo/Oxa组细胞,差异有统计学意义(t=-12.520,P<0.01)。

2.3 LoVo/Oxa组与LoVo/Oxa+TPL组细胞增殖能力比较

0、24 h时,2组细胞的增殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05); 48、72、96 h时,LoVo/Oxa+TPL组细胞的增殖能力显著低于LoVo/Oxa组细胞,差异有统计学意义(P<0.05);LoVo/Oxa+TPL组细胞克隆数显著多于LoVo/Oxa组,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表2和图1。

图1 2组细胞增殖能力(克隆形成实验)Fig.1 Cell proliferation of in the two groups(colony formation assay)

表2 2组细胞增殖能力比较Tab.2 Comparison of cell proliferation ability between the two groups

2.4 LoVo/Oxa 组与LoVo/Oxa+TPL组细胞周期和细胞凋亡比较

LoVo/Oxa+TPL组细胞中G1、G2期细胞占比显著低于LoVo/Oxa 组,差异有统计学意义(P<0.01);LoVo/Oxa+TPL组细胞中S期细胞占比显著高于LoVo/Oxa 组,差异有统计学意义(P<0.01);LoVo/Oxa+TPL组细胞的凋亡率显著高于LoVo/Oxa组,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表3和图2。

A:LoVo/Oxa组细胞周期;B:LoVo/Oxa+TPL组细胞周期;C:LoVo/Oxa组细胞凋亡;D:LoVo/Oxa+TPL组细胞凋亡。图2 LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组细胞周期和细胞凋亡情况(流式细胞术)Fig.2 Cell cycle and cell apoptosis in LoVo/Oxa group and LoVo/Oxa+TPL group(flow cytometry)

表3 2组细胞的细胞周期分布和细胞凋亡率比较Tab.3 Comparison of cell cycle distribution,apoptosis rate between the two groups

2.5 LoVo/Oxa 组与LoVo/Oxa+TPL组迁移细胞和侵袭细胞数比较

LoVo/Oxa+TPL组迁移细胞数和侵袭细胞数显著低于LoVo/Oxa组,差异有统计学意义(P<0.01),见图3和表4。

A:LoVo/Oxa组迁移细胞;B:LoVo/Oxa+TPL组迁移细胞;C :LoVo/Oxa组侵袭细胞;D:LoVo/Oxa+TPL组侵袭细胞。图3 2组细胞迁移、侵袭情况(结晶紫染色,× 200)Fig.3 Cell migration and invasion in the two groups(crystal violet staining,× 200)

表4 2组迁移细胞数和侵袭细胞数比较Tab.4 Comparison of the number of migration and invasion of cells between the two groups

2.6 LoVo/Oxa组与LoVo/Oxa+TPL组细胞中细胞周期蛋白、耐药相关蛋白、凋亡相关蛋白及迁移侵袭相关蛋白表达的比较

LoVo/Oxa+TPL组细胞中Cyclin D1、Rb、MDR1、P-gp、Bcl-2、Vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达量显著低于LoVo/Oxa组,Bax、Cl-caspase-3、E-cad蛋白相对表达量显著高于LoVo/Oxa组,差异有统计学意义(P<0.01);2组细胞中caspase-3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图4和表5。

A:LoVo/Oxa组;B:LoVo/Oxa+TPL组。图4 LoVo/Oxa组和LoVo/Oxa+TPL组细胞中蛋白表达(免疫印迹法)Fig.4 Expression of protein in cells in the two groups(Western blot)

表5 2组细胞中CyclinD1、Rb、MRP1、P-gp、Bax、Bcl-2、caspase-3、Cl-caspase-3、Vimentin、E-cad、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量比较Tab.5 Comparison of the relative expressions of CyclinD1,Rb,MRP1,P-gp,Bax,Bcl-2,caspase-3,Cl-caspase-3,Vimentin,E-cad,MMP-2,MMP-9 proteins in cells between the two groups

3 讨论

结直肠癌因其高发病率和对现有化学治疗药物的耐药性导致其病死率较高,亟需寻找新的治疗药物及策略[28]。TPL是中草药雷公藤的主要成分之一,虽然其在临床前研究中显示出强大的抗肿瘤活性,但由于其严重的全身毒性而在临床应用中受到限制。越来越多的证据表明,低剂量TPL可部分缓解结直肠癌对当前化学治疗药物的耐药性,增强化学治疗药物的抗癌效果,并减轻其毒性[6-8,14-15,19-21,23-24]。另外,有研究表明,TPL 可以抑制耐药癌细胞的恶性生物学特征[5-25]。

本研究结果发现,TPL可以降低LoVo/Oxa细胞的耐药性,并通过将细胞周期阻滞在S期来抑制LoVo/Oxa细胞的增殖和克隆形成。恶性肿瘤耐药性的发生与肿瘤细胞的增殖、凋亡异常和自噬等密切相关[29-31]。本研究中,TPL呈剂量依赖性抑制LoVo细胞和LoVo/Oxa细胞的增殖能力。以往有研究表明,TPL能诱导食管鳞状细胞癌细胞周期停滞在G1/S期,从而抑制细胞生长[24]。本研究还发现,TPL具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。有研究表明,TPL通过抑制细胞增殖、阻断细胞周期、干扰肿瘤血管生成、诱导自噬和促进细胞凋亡发挥强大的抗肿瘤作用[5-25]。本研究发现,TPL可显著增加LoVo/Oxa细胞凋亡率。细胞凋亡是由凋亡相关基因控制的程序性死亡过程,caspase-3的激活长期以来被认为是细胞凋亡的标志[29-32],Bax、Bcl-2 是重要的凋亡相关蛋白,当线粒体通路被氧化应激等细胞凋亡信号激活时,Bax 等促凋亡蛋白表达上调[32]。Bcl-2相关抗凋亡作用的过度激活与癌症的发生、进展和预后相关,还可导致各种恶性肿瘤的放射和化学抗性[8-9,17,23,25,31]。TPL的抗肿瘤活性与诱导线粒体凋亡途径和caspase激活有关。本研究发现,无毒剂量的 TPL 处理LoVo/Oxa细胞48 h后可上调Cl-caspase-3、Bax的表达,下调Bcl-2的表达,提示TPL可能经线粒体途径诱导LoVo/Oxa细胞的凋亡。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在生理或病理因素的作用下转化为间充质细胞的过程,上皮细胞失去极性和与相邻细胞的连接,使得细胞的增殖能力明显增强,容易发生迁移、侵袭和凋亡抵抗[33-35]。有研究发现,EMT赋予肿瘤细胞在继发性肿瘤形成过程中适应不断变化的微环境能力,EMT的发生使肿瘤细胞的抗凋亡能力增强,进而降低放射治疗、化学治疗、靶向治疗和免疫治疗的疗效[36]。有研究证实,Wnt/β-catenin信号的异常激活可促进结直肠癌细胞中的EMT活性和一些顺铂类药物的耐受性[37-38]。由于EMT诱导了结直肠癌的耐药性,因此,抑制EMT的激活和上皮-间质可塑性已成为解决结直肠癌对化学治疗耐药的有效方法。本研究发现,TPL处理LoVo/Oxa细胞会抑制细胞的迁移和侵袭,使上皮细胞的蛋白标志物E-cad表达上调,Vimentin的表达下调,同时可抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表达;与先前的研究结果一致[6,10]。

在全球范围内,结直肠癌给医疗保健系统带来了沉重的负担[2]。TPL是一种具有新型抗癌作用的天然药物[5],TPL除了具有抗炎和免疫抑制作用外,还有较强的抗肿瘤作用,主要表现在抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡,增强某些化学治疗药物的促凋亡效果[5-23]。关于逆转结直肠癌细胞多药耐药的研究较少。在本研究构建了结直肠癌奥沙利铂耐药细胞系LoVo/Oxa,并利用无毒剂量的TPL来逆转结直肠癌对Oxa的耐药性,结果显示,TPL与Oxa联合可使LoVo/Oxa细胞的IC50显著下降,并改变了LoVo/Oxa的细胞周期,提高了细胞的凋亡率,这提示TPL可通过诱导细胞凋亡来逆转LoVo/Oxa的耐药作用。本研究进一步发现,TPL可显著下调LoVo/Oxa细胞中增殖与耐药相关蛋白(Cyclin D1、Rb、P-gp、MDR1)、Bax、Cl-caspase-3、Vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白的表达,显著上调促凋亡蛋白Bcl-2及上皮细胞蛋白标志物E-cad蛋白的表达,这从分子机制上初步阐明了TPL逆转结直肠癌细胞对Oxa耐药的原因。

4 结论

TPL对结直肠癌耐药细胞LoVo/Oxa的耐药性有一定的逆转作用。但本研究仅在细胞层面证实了TPL可以逆转LoVo/Oxa的耐药性,为了进一步证实其体内的作用效果,未来的研究将对TPL逆转结直肠癌的耐药作用在体内的效果进行验证,以期为TPL在临床中的应用提供更好的理论支撑。