苦参碱对H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9c2氧化损伤的保护作用及分子机制

赵希坤，闫鹏，赵飞龙，王可

氧化应激在各种疾病过程中均发挥着重要作用，包括癌症、炎症、心血管疾病等[1]。许多研究已证实，心肌缺血/再灌注引起的心肌细胞损伤主要是由于活性氧簇（ROS）的大量产生，进而通过激活各种信号通路诱导心肌细胞凋亡，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等[2]，可能有助于心功能障碍和心力衰竭的发生和进展。苦参碱是提取于豆科植物苦参果实或地上部分的一种生物碱，具有抗炎、抗纤维化、抗肿瘤和抗病毒等多种重要的药理作用[3]。彭兴等[4]发现苦参碱可通过恢复心肌梗死大鼠辅助性T细胞平衡、降低心肌梗死面积起到心肌保护作用。H2O2处理的H9c2细胞株已被广泛用作体外心肌损伤模型，以研究药物对氧化损伤心肌细胞的保护作用[5]。因此本研究采用H2O2处理的H9c2细胞株作为实验对象，观察苦参碱对心肌损伤的影响及MAPK信号通路的抑制作用，从而为证实苦参碱在治疗心血管疾病方面的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料大鼠心肌细胞H9c2购自中国上海科学院上海生物科学研究所细胞资源中心；苦参碱（M5319，分子量248.37，纯度＞99.0%）购自美国Sigma-Aldrich公司；H2O2购自北京化工厂；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK-8 试剂盒、活性氧簇（ROS）检测试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）和过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；荧光染料JC-1是购自美国Sigma-Aldrich公司。ROS荧光测定试剂盒购自美国BioVision公司；AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司；p38 MAPK、JNK抗体都购自美国Santa Cruz公司。MAPK通路激活剂-茴香霉素（AM）购自美国Selleckchem公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养大鼠心肌细胞H9c2在含10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、1%非必需氨基酸，100 IU/ml青霉素，100 g/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle高糖培养基（DMEM）中培养，培养条件为37℃、5%CO2饱和湿度。扩增培养后，取P3～7代细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞分组将大鼠H9c2细胞分为五组：①空白组（不做任何特殊处理）；②苦参碱组（正常培养+50 μmol/L苦参碱培养24 h）；③H2O2模型组（200 μmol/L H2O2预处理H9c2细胞3 h）；④H2O2+苦参碱组（200 μmol/L H2O2预处理H9c2细胞3 h后加入50 μmol/L苦参碱培养24 h）；⑤H2O2+苦参碱+AM组（200 μmol/L H2O2预处理H9c2细胞3 h后加入50 μmol/L苦参碱和5 μmol/L AM培养24 h）。

1.2.3 H2O2损伤模型建立对数生长期的H9c2细胞用胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为1×105/ml，而后接种于96孔板，每孔100 μl，设8个平行孔，于5% CO2，37℃培养箱中培养24 h。去上清，加入用DMEM稀释的终浓度分别为0、20、50、100、200、400 μmol/L的H2O2，空白组只加入DMEM，分别处理6 h和12 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37℃培养箱中继续培养，4 h后在酶联免疫检测仪波长450 nm处测定各孔吸光值（OD值），并计算细胞存活率。选择细胞存活率在50%左右的H2O2浓度建立损伤模型。细胞存活率（%）=（OD处理－OD空白）/（OD对照－OD空白）×100%

1.2.4 CCK-8法检测心肌细胞增殖活性取H9c2细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，以1×105/ml密度接种于96孔板中，每孔100 μl，每组设8个平行孔。随机选择6组进行常规培养，加入不同浓度的苦参碱（0、1、5、25、50、100 μmol/L）作用24 h；另外6组细胞加入200 μmol/L H2O2预处理3 h，然后加入不同浓度的苦参碱（0、1、5、25、50、100 μmol/L）作用24 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液继续培养3～4 h，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔吸光值（OD值）。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况收集各组细胞，用4 ℃预冷无菌的磷酸缓冲盐溶液（PBS）充分洗涤细胞2次，用 1 ml 1×Binding Buffer 重悬细胞（1×106个/ml），每管加入100 μl细胞（1×105个）与5 μl Annexin V-FITC结合，室温避光10 min，而后加入5 μl PI，5 min后加入500 μl结合缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 LDH水平和抗氧化酶活性检测按1.2.2方法对H9c2细胞进行处理，1200 r/min离心15 min，收集细胞培养上清，用LDH试剂盒检测各组细胞培养上清中LDH和MDA水平。另外收集各组细胞，用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞，收集上清液，用试剂盒检测细胞内LDH、SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.2.7 ROS含量检测离心后收集各组细胞，加入20 μmol/L DCFH-DA荧光染料37 ℃避光孵育30 min。用PBS洗涤2次后，流式细胞仪捕获荧光信号，信号强度以空白组的倍数表示。

1.2.8 用JC-1荧光染色法测定线粒体跨膜电位（ΔΨ）离心后收集各组细胞，用PBS洗涤，加入2 μmol/L JC-1荧光染料37 ℃避光孵育30 min。用PBS洗涤2次后，而后用流式细胞仪进行分析。

1.2.9 蛋白免疫印迹法（western blot）收集各组细胞，用含有1%苯甲基磺酰氟的细胞裂解液，冰浴上裂解30 min。用BCA试剂盒定量蛋白样品浓度。用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶将等量的蛋白质进行电泳，并电转移（100 V，55 min）到硝酸纤维素膜上。用5%脱脂乳在室温下封闭膜至少2 h，与p38、p-p38、JNK、p-JNK初级抗体（1:200）4℃下孵育过夜，在室温下与相应的HRP结合的次级抗体孵育2 h。在摇床上洗膜3次，30 min/次，而后用增强的化学发光溶液进行可视化。蛋白表达水平根据内参β-actin进行标化。

1.3 统计学分析采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，结果以均数±标准差表示，采用单因素方差分析和LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 确定H2O2作用于H9c2细胞的时间和浓度采用不同浓度H2O2处理H9c2细胞3 h时，IC50约为（195.64±13.57）μmol/L，故H2O2作用浓度设为200 μmol/L；同样经200 μmol/L H2O2处理H9c2细胞3 h时，细胞存活率约为50%，故细胞建模条件为200 μmol/L H2O2预处理3 h（图1）。

图1 不同浓度H2O2处理3h或200 μmol/L H2O2处理不同时间时H9c2细胞的存活率曲线

图2 苦参碱能够促进H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9c2的增殖活性

2.2 苦参碱对H2O2诱导H9c2细胞增殖活性的影响对于常规培养的H9c2细胞，不同浓度的苦参碱作用24 h对细胞存活率几乎无影响（P＞0.05）；然而对于200 μmol/L H2O2预处理3 h的H2O2-H9c2细胞，不同浓度的苦参碱可提高细胞存活率，与模型组相比，均有统计学差异（P＜0.05）；当苦参碱浓度为50 μmol/L和100 μmol/L时，细胞存活率比较无统计学差异（P＜0.05），且50 μmol/L苦参碱作用24 h时，H2O2-H9c2细胞存活率超过85%。故选择50 μmol/L苦参碱用作后续机制研究。

2.3 苦参碱对H2O2诱导的H9c2细胞凋亡的影响与空白组相比，苦参碱组细胞凋亡率无统计学差异（P＞0.05），但H2O2模型组细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）。与H2O2模型组相比，H2O2+苦参碱组细胞凋亡率显著下降（P＜0.05），与H2O2+苦参碱组相比，H2O2+苦参碱+AM组细胞凋亡率增加（P＜0.05），（图3）。

图3 流式细胞术检测各组H9c2细胞凋亡情况

2.4 苦参碱对H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9c2氧化应激相关因子的影响与空白组相比，苦参碱组LDH、MDA、SOD、GSH-Px、CAT含量无明显变化（P＞0.05），但H2O2模型组细胞培养上清中LDH和MDA水平增加，且细胞中SOD、CAT和GSH-Px活性降低（P＜0.05）。与H2O2模型组相比，H2O2+苦参碱组细胞培养上清中LDH和MDA水平降低，且细胞中SOD、CAT和GSH-Px活性增加（P＜0.05）；然而与H2O2+苦参碱组相比，H2O2+苦参碱+AM组上述指标的变化均被逆转（P＜0.05），表1。

表1 苦参碱对H2O2诱导的H9c2细胞LDH、MDA、SOD、GSH-Px、CAT活性的影响（n=8）

2.5 苦参碱对H2O2诱导的H9c2细胞ROS生成量的影响与空白组相比，苦参碱组细胞ROS生成量无统计学差异（P＞0.05），但H2O2模型组细胞ROS生成量明显增加（P＜0.05）。与H2O2模型组相比，H2O2+苦参碱组细胞ROS生成量显著下降（P＜0.05），与H2O2+苦参碱组相比，H2O2+苦参碱+AM组细胞ROS生成量升高（P＜0.05），（图4）。

图4 流式细胞术分析各组细胞ROS生成情况

2.6 苦参碱对H2O2诱导的H9c2细胞线粒体膜电位（ΔΨ）的影响与空白组相比，苦参碱组JC-1单体阳性细胞百分比无统计学差异（P＞0.05），但H2O2模型组JC-1单体阳性细胞百分比明显增加（P＜0.05）。与H2O2模型组相比，H2O2+苦参碱组JC-1单体阳性细胞百分比显著下降（P＜0.05），与H2O2+苦参碱组相比，H2O2+苦参碱+AM组JC-1单体阳性细胞百分比升高（P＜0.05），（图5）。

图5 流式细胞术观察苦参碱苦参碱对H2O2诱导的H9c2细胞线粒体膜电位（ΔΨ）的影响

2.7 苦参碱对H2O2诱导的H9c2细胞MAPK通路相关蛋白表达的影响与空白组相比，苦参碱组（p-P38 MAPK）/（P38 MAPK）比值和（p-JNK）/（JNK）比值无统计学差异（P＞0.05），但H2O2模型组（p-P38 MAPK）/（P38 MAPK）比值和（p-JNK）/（JNK）比值明显增加（P＜0.05）。与H2O2模型组相比，H2O2+苦参碱组（p-P38 MAPK）/（P38 MAPK）比值和（p-JNK）/（JNK）比值显著下降（P＜0.05），与H2O2+苦参碱组相比，H2O2+苦参碱+AM组（p-P38 MAPK）/（P38 MAPK）比值和（p-JNK）/（JNK）比值则被逆转（P＜0.05），（图6）。

图6 Western blot法检测苦参碱对H2O2诱导的H9c2细胞P38、JNK蛋白表达及磷酸化水平的影响

3 讨论

心血管疾病是世界范围内发病率和死亡率最高的一类疾病[6]。高血压、糖尿病、缺血/再灌注和抗肿瘤药物能够通过氧化应激诱导细胞核和线粒体DNA损伤、细胞内蛋白变性、脂质过氧化和炎症，从而使心肌细胞凋亡或坏死，最终导致心力衰竭[7]。氧是生命活动所必需的，其在生物学上具有明显作用，能够参与生物信号的转导、基因的转录等生物行为。然而，氧过量时会以自由基和ROS的形式对细胞分子产生负面影响，此种不利影响也是不容忽视的[8]。低效率的氧化磷酸化可产生ROS，导致线粒体功能障碍。一般来说，较低浓度的ROS对正常的细胞信号传导至关重要，而较高浓度和较长时间暴露的ROS会对细胞内DNA、脂质和蛋白质等细胞大分子造成损伤，最终导致坏死和凋亡细胞死亡[9]。研究证实氧化应激是心血管疾病的主要危险因素，过量的ROS可引起氧化应激，可导致心脏内皮功能受损[10]。

苦参碱家族生物碱作为中药苦参、苦参、苦豆中的四环喹啉嗪类似物具有多种药理活性，近年来引起了人们的广泛关注[11]。本研究目的是探讨苦参碱对H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9c2氧化应激损伤的保护作用，并研究其具体的分子机制。心肌细胞凋亡也是导致心肌损伤的主要因素之一，在氧过量环境下，H2O2通过诱导线粒体去极化和膜电位的耗散导致H9c2细胞凋亡和线粒体损伤[12]。本研究中，首先建立大鼠心肌细胞H2O2损伤模型，以确保大鼠心肌细胞确实处于氧化应激损伤环境，为后续实验做准备。随后CCK-8、流式细胞术、ELISA、TBA等实验结果表明，苦参碱可减少ROS的产生，进而抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡和线粒体损伤，并维持心肌细胞存活率，证实苦参碱对心肌细胞氧化应激损伤具有一定保护作用。H2O2是一种强氧化剂，显著降低细胞活性，增加细胞凋亡。本研究通过测定细胞培养上清中LDH、MDA活性以及细胞内SOD、GSH-Px、CAT活性，进一步探讨苦参碱的心肌保护作用。乳酸脱氢酶测定法被广泛用于量化LDH的释放水平。MDA水平以及各种抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活性也作为氧化损伤和心肌功能的指标。在本研究中，与H2O2模型组相比，H2O2+苦参碱组细胞培养上清中LDH和MDA水平降低，且细胞中SOD、CAT和GSH-Px活性增加；然而上述各种指标的变化却被MAPK通路激活剂-AM所逆转。说明苦参碱可能是通过调节MAPK信号通路的活性进而保护心肌细胞免受氧化应激损伤。

MAPK是多种细胞外刺激诱导mRNA表达、信号通路活化等反应的交汇点，其在多种疾病的发生发展中发挥重要作用，包括调节细胞的生存、增殖、分化和凋亡[13]。氧化应激可引起MAPK磷酸化连锁反应，进而调控下游一系列信号通路的活化或抑制，从而发挥心肌保护作用[14]。MAPK通路包括多种信号级联：P38MAPK、JNK/SAPK等，据报道它们在调节凋亡和其他细胞程序中发挥着重要作用。以往的研究表明，H2O2可诱导H9c2细胞MAPK通路的激活[15]。本研究通过Western blot法发现，与H2O2模型组相比，苦参碱可降低（p-P38 MAPK）/（P38 MAPK）比值和（p-JNK）/（JNK）比值，而后用MAPK通路激活剂-AM进行挽救实验，发现H2O2+苦参碱+AM组可逆转苦参碱对H2O2诱导的细胞凋亡的保护作用。说明苦参碱保护心肌细胞氧化应激损伤的作用可能部分与MAPK信号通路的调控有关。

综上所述，本研究结果表明，苦参碱通过减少ROS的产生、增强抗氧化酶系统、维持线粒体功能等，对H9c2心肌细胞氧化应激损伤具有一定保护作用，且这种保护作用至少部分依赖于MAPK信号通路的调控。该研究为苦参碱治疗心肌梗死和心力衰竭的深入研究及临床应用提供参考。