基于网络药理学及分子对接技术探讨药食两用中药栀子致肾损伤的毒理机制*

丁彦敏,袁颢宸,王宁

山东中医药大学,山东 济南 250355

中药栀子是茜草科植物栀子的干燥成熟果实,其主要功效为泻火除烦、清热利湿、凉血解毒,外用凉血消肿,临床用于热病心烦、湿热黄疸、淋证涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡等,也可外用以治疗扭挫伤痛[1]。栀子入选第一批药食两用中药材目录,逐渐被人们了解,并在日常生活中得到广泛应用[2]。近年来,栀子导致肾损伤的报道逐渐增多[3-5],但是相关作用机制的报道比较少。本研究基于网络药理学研究方法,系统分析药物与疾病和靶点之间的关系网络,探讨栀子导致肾损伤的作用机制,为药食两用中药栀子的应用提供思路和借鉴。

1 资料与方法

1.1 栀子活性成分与靶点的筛选采用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)筛选栀子活性成分和潜在靶点,设定筛选活性成分的条件为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%且类药性指数(drug-likeness,DL)≥0.18;在Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)将栀子活性成分相关靶点信息校准为标准基因名。另外在中医药综合数据库(traditional Chinese medicine integrated database,TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/)检索栀子化学成分,并在Swiss Target Prediction平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测基因靶点。把两次所得靶点合并取交集作为栀子活性成分的靶点。

1.2 肾损伤靶点的筛选以“kidney injury”为关键词,在NCBI临床突变数据库(ClinVar,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、人类基因注释数据库(GeneCards,https://www.genecards.org/)、在线人类孟德尔遗传数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM,https://omim.org/)和治疗靶点数据库(therapeutic target database,TTD,http://db.idrblab.net/ttd/)检索肾损伤的相关靶点。若GeneCards数据库获得靶点过多,则设置score≥中位数进行筛选。将得到的疾病靶点汇总并去除重复值,获得肾损伤疾病靶点。

1.3 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络的构建通过Venny软件对药物相关靶点与疾病靶点取交集,获得栀子导致肾损伤的潜在靶点。在Cytoscape 3.8.0中构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络。以“节点”(node)代表属性类型,即药物、活性成分、靶点和疾病,“边”(edge)代表交互关系。采用 Cytoscape的Network Analyzer工具分析所构建的网络,结果中连接度(degree)越大,涉及的生物功能越多,重要性越高。

1.4 蛋白质互作网络(protein-protein interaction networks,PPI)构建将栀子导致肾损伤的靶点提交至STRING 11.0平台,物种选择“Homo sapiens”,设定“highest confidence>0.9”并隐藏游离节点,获取蛋白质互相作用图,构建PPI网络,根据结果对靶点蛋白进行分析。

1.5 富集分析通过Metascape平台(http://metascape.org)对靶点进行富集分析,将药物与疾病交集靶点导入Metascape平台进行基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析。GO分析解释关键靶点导致肾损伤的生物过程,KEGG富集分析研究其相关信号通路。基于KEGG结果,选取前10条通路,运用Cytoscape3.8.0构建“关键通路-潜在靶点-化学成分”网络进一步筛选栀子导致肾损伤的关键靶基因及有效活性成分。

1.6 分子对接检索ZINC数据库(http://zinc.docking.org/)下载栀子活性成分的PDB格式文件,并选为配体。检索RSCB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)并下载靶点蛋白的3D结构,选为受体。利用AutoDock Vina软件进行分子处理和对接,用PyMOL软件进行图像的可视化分析。一般认为,结合能≤-5.5 kcal·mol-1为结合活性好,结合构象稳定。

2 结果

2.1 栀子靶点基因的获取从TCMSP获取栀子活性成分靶点基因,在Uniprot数据库标准化后获得靶点基因176个;从TCMID数据库获取栀子化学成分,并在Swiss Target Prediction预测后获得靶点基因871个。汇总去重后共获得化学成分119个,靶点基因920个。

2.2 疾病靶点及潜在靶点的获取在GeneCards数据库获得肾损伤潜在靶点为8 233个,根据经验以score≥中位数为筛选条件,第1次筛选设置score≥3.39,获得4 120个靶点;第2次筛选设置score≥6.955,获得2 060个靶点;第3次筛选设置score≥11.555,获得1 030个靶点作为肾损伤的潜在靶点。在ClinVar、TTD、OMIM数据库检索“kidney injury”,分别得到168个、3个、74个靶点,汇总并去重后,共获得 1 234 个疾病靶点。通过Venny将药物与疾病靶点取交集,共得到244个栀子导致肾损伤的潜在靶点,见图1。

2.3 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络的构建运用Cytoscape 3.8.0构建“药物-活性成分-靶点-疾病”网络,见图2。绿色圆形表示栀子活性成分,蓝色菱形表示靶点基因,黄色六边形表示疾病,紫色三角形表示药物。该网络节点大小代表相应的Degree值,Degree值越大则节点面积越大。化合物Degree值前四位是槲皮素(quercetin)、urushio iii、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone)和绿原素(chlorogenin),这可能是栀子导致肾损伤的主要活性成分。靶点基因Degree值排名前5位是PTGS2、AKR1B1、ADORA2A、MMP2、KDR。

图2 “药物-活性成分-靶点-疾病”网络

2.4 PPI网络的构建在STRING平台构建PPI网络,见图3。PPI网络中包含244个节点和1 240条边,并将出现频率前10位的靶点绘制条形图,见图4。蛋白互作频次较高的有AKT1、APP、HRAS、EGFR、CTNNB1等,说明栀子活性成分与肾损伤有较高结合活性,可以认为是栀子导致肾损伤的关键靶点。

图3 潜在靶点PPI网络

图4 关键靶点蛋白互作频次图

2.5 富集分析在Metascape平台上对244个交集靶点进行GO和KEGG分析。GO分析共得到3 607个条目,其中分子功能(molecular function,MF)285个,细胞组分(cellular component,CC)185个,生物学过程(biological process,BP)3 137个,以P<0.01为筛选条件,共得到497个条目,分别从MF、CC、BP中选择排名前10位的条目做GO富集分析三合一柱状图,见图5。涉及的主要GO进程有对有毒物质的反应(response to toxic substance)、积极调控细胞迁移(positive regulation of cell migration)、细胞对有机氮化合物的反应(cellular response to organonitrogen compound)、对细胞外刺激的反应(response to extracellular stimulus)、对无机物的反应(response to inorganic substance)、膜筏(membrane raft)、蛋白酶结合(protease binding)和磷酸酶结合(phosphatase binding)等。

图5 GO富集分析图

KEGG分析得到379条信号通路,以P<0.01为筛选条件,则得到276条信号通路。取排名前20位的信号通路绘制KEGG气泡图,见图6。每张图左侧为排名靠前的通路名称,横轴代表该通路基因所占总体输入基因的比率,气泡大小表示富集到靶标的数量,气泡颜色由红到绿表明P值由大到小,红色气泡越大说明该条信号通路的重要性越高。KEGG结果包括癌症通路(pathways in cancer)、癌症中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、cAMP信号通路(cAMP signaling pathway)和癌症中的转录失调(transcriptional misregulation in cancer)等。

注:Ratio为某通路基因所占总体输入基因的比率。图6 KEGG气泡图

运用Cytoscape 3.8.0构建“关键通路-潜在靶点-化学成分”网络以进一步揭示信号通路与候选靶标及活性成分之间的关系,见图7。从网络中可知,活性成分Degree值前3位为槲皮素(quercetin)、urushio iii和5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone),可能是栀子导致肾损伤的主要活性物质,与“药物-活性成分-靶点-疾病”网络中一致。根据Degree值筛选得到的关键靶基因为PTGS2、AKR1B1、ADORA2A、MMP2、EGFR、KDR等。

图7 “关键通路-潜在靶点-化学成分”网络图

2.6 分子对接分析检索文献发现,槲皮素(quercetin)与5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮没有导致肾损伤的直接证据,urushio iii则暂未有临床或实验研究证明其有导致肾损伤的作用。而栀子苷是栀子的主要成分,《中华人民共和国药典》将其作为栀子质量评价的目标成分[1],且有文献报道栀子苷具有肾毒性[6-8],故本研究将栀子苷(geniposide)选择为配体,根据Degree值选择“药物-活性成分-靶点-疾病”网络排名前5位、PPI网络排名前10位以及“关键通路-潜在靶点-化学成分”网络排名前6位的靶点作为受体进行分子对接,结果见表1,选取对接结合能较小的4个结果展示,见图8。栀子苷与靶点蛋白APP在DG9、DG10、DG15氨基酸位点结合生成氢键;栀子苷与MMP2在ASP622氨基酸位点结合生成氢键;栀子苷与AKR1B1在ARG3、LYS11氨基酸位点结合生成氢键;栀子苷与AKT1在ARG215、ARG320氨基酸位点结合生成氢键。结果表明,栀子苷与靶点蛋白APP、MMP2、AKR1B1、AKT1之间有良好的结合活性。

表1 栀子活性成分与靶点蛋白对接结果

3 讨论

栀子作为药食两用中药材,具有保肝利胆、抗炎、降血脂、促进胰腺分泌、保护神经、抗氧化、抗血栓等作用[9],但是目前有研究报道,栀子有肾毒性,明确其毒理机制具有重要意义。网络药理学可以作为桥梁来联系中药与现代药理学,从系统上揭示中药对机体网络的调控作用,更加全面地认识中药的作用机制。因此,本研究运用网络药理学探讨栀子导致肾损伤的毒理机制,以期为栀子的临床和食品应用安全提供参考。

基于网络药理学方法及既往研究发现,栀子苷(geniposide)、槲皮素(quercetin)、5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮(5,7,3′,4′,5′-pentamethoxyflavone)和urushio iii可能是栀子导致肾损伤的主要活性成分。冯筱懿等[6-7]研究发现,在栀子苷相同剂量(100 mg·kg-1)的条件下,短期(3 d)给药对大鼠肾功能影响较小,长期(90 d)给药则会对部分大鼠肾脏造成损伤,但是短期(3 d)给予大鼠大剂量(300 mg·kg-1)的栀子苷则会明显导致大鼠肾脏损伤,这说明栀子苷小剂量长期应用或者短期内大剂量应用均会导致肾损伤。程生辉等[8]经实验研究发现,用不同剂量的栀子苷喂养大鼠后,大鼠出现了不同程度的肾损伤,并且栀子苷应用的剂量越大,大鼠肾损伤越严重,说明栀子苷具有肾毒性。槲皮素具有抗氧化和清除氧自由基、抗炎等作用[10],但能否导致肾损伤尚需要进一步的研究。而对5,7,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮的已有研究中也尚未发现其导致肾损伤的直接证据[11]。对于urushio iii,目前暂无关于其毒理作用的临床或实验研究,可能是栀子导致肾损伤的又一发现,值得进一步探索。

在基因层面,PTGS2、AKR1B1、MMP2、EGFR、KDR等被认为是栀子导致肾损伤的关键靶点。PTGS2基因表达环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),COX-2是在炎症细胞因子和应激条件下诱导表达的一种酶,在肾缺血再灌注损伤发生后表达先增加到最大再减少,在其表达数小时后可以使肾损伤最严重,这说明COX-2对肾损伤的发展起到了促进作用[12]。谭峰[13]研究发现,通过药物抑制COX-2可以起到缓解肾损伤的作用,这说明COX-2可能有促进肾损伤进一步发展的作用。对AKR1B1的研究发现,AKR1B1在肾脏中高表达,将葡萄糖转化为山梨糖醇,但这个过程不活跃,只有在血糖水平相对较高的情况下才被激活,进而导致山梨糖醇的水平升高,因为山梨糖醇很难扩散到细胞外,导致高渗透压,虽然AKR1B1可以提供对高渗环境的保护,但高渗透不断地累积会破坏肾细胞的渗透调节,最终导致肾脏损伤[14-15]。研究发现,血清MMP2可能是导致糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)患者肾损害的原因之一[16]。研究发现,MMP2在肾组织中有表达,并且在肾癌细胞中的表达相对较高,说明MMP2参与了肾损伤的发展[17]。此外MMP2有降解细胞外基质的作用,杜文孝等[18]认为MMP2通过降解细胞外基质来参与肾脏缺血再灌注损伤的发展;而郑学双等[19]研究发现肾脏缺血再灌注可通过激活p38MAPK诱导MMP2蛋白表达来降解细胞外基质,进而促进肾缺血再灌注的发展。MMP2降解细胞外基质的机制也可以加快肾癌细胞的侵袭转移[17]。慢性肾病期间脂质运载蛋白2(lipocalin 2,Lcn2)的表达可诱导EGFR定位到肾小管细胞表面,从而使受体持续激活,导致肾损伤[20]。阻断EGFR与TGF-α结合来阻止足细胞的损伤可能会延缓DN发展,这表明EGFR也有促进DN发展的作用[21]。EGFR可以作为治疗肾脏疾病的潜在靶点,EGFR配体EGF主要通过调节细胞增殖参与急性肾损伤[22]。KDR即为血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2),广泛存在于人的主要内脏系统中,是III型受体酪氨酸激酶基因。周琪等[23]研究发现,雷帕霉素可能通过抑制KDR分泌来改善肾损伤大鼠的情况,说明KDR会使肾损伤进一步加重。

GO结果表明栀子是通过调控蛋白酶结合、磷酸酶结合和对细胞外刺激的反应来导致肾损伤的。蛋白酶中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)对肾有损伤作用,MMPs通过降解细胞外基质各种成分、促炎效应、破坏肾小管周围毛细血管等机制影响肾脏缺血再灌注的进一步发展。磷酸酶中血清碱性磷酸酶可造成肾损伤,颜春鲁等[24]认为在镉导致的肾损伤中,镉能和血清碱性磷酸酶紧密结合,从而使血清碱性磷酸酶含量增加,进而对肾脏造成不同程度的损伤。在对细胞外刺激的反应研究中,黄小抗等[25]研究发现,通过高糖环境的刺激,小鼠的肾组织会发生炎症,并且系膜细胞和基质也会有所增加。

通路富集分析结果显示,栀子导致肾损伤可能主要通过AGEs-RAGE信号通路、cAMP信号通路、NF-κB信号通路等实现。AGEs-RAGE信号通路对DN发生发展有促进作用[26]。汪容等[27]研究发现,DN的发生是通过AGEs-RAGE介导氧化应激通路活化实现的。黄倩等[28]在实验中发现,DN小鼠肾皮质中cAMP含量升高,表明cAMP信号通路参与了DN状态下肾纤维化。连晓英等[29]研究发现,cAMP可以刺激多囊肾病细胞的增殖以及生长,进一步加重肾损伤。在没有受到刺激时,NF-κB和IκB结合存在于细胞质中,在受到刺激后 NF-κB 与IκB结合物被降解,NF-κB进入细胞核诱导多种炎症因子表达。万笑笑[30]在研究中发现,NF-κB 引起的炎症反应可以加重肾损伤。NF-κB被激活后诱导表达的炎症因子也可以促进DN的发生发展[31-32]。朱晓婷等[33]研究发现,NF-κB信号通路介导的炎症反应可促进肾纤维化的发展。

本研究表明,栀子导致肾损伤的主要成分可能是栀子苷,与调控蛋白酶结合、磷酸酶结合以及对细胞外刺激的反应密切相关,涉及AGEs-RAGE信号通路、cAMP信号通路、NF-κB信号通路。为进一步开发利用药食两用中药材栀子,尚需相应的体内外实验来验证本研究的结果。