circ-AFF2表达水平与类风湿关节炎疾病活动度的相关性研究

平佃辉

[摘要] 目的 探討类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者外周血及关节滑液中的circ-AFF2表达水平与疾病活动度的关系。方法 选取2019年12月至2022年4月浙江中医药大学附属湖州中医院治疗的90例RA患者纳入RA组，记录其临床资料与实验室指标，根据RA疾病活动度评分（disease activity score-28，DAS28）将纳入患者分为低活动度组（n=32）、中活动度组（n=34）和高活动度组（n=24）；收集同期87例关节损伤患者纳入对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定两组患者外周血与关节滑液中的circ-AFF2表达水平，并检测相关实验室指标和膝关节超声指标。结果 RA组患者外周血与关节滑液中的circ-AFF2水平均显著高于对照组（P<0.05）。低活动度组、中活动度组、高活动度组患者的外周血与关节滑液中circ-AFF2表达水平及类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、抗环瓜氨酸肽（anti-cyclic cirtrullinated peptide，CCP）、滑膜厚度依次升高，滑膜血流分级、滑膜动脉阻力指数（resistance index，RI）依次降低（P<0.05）。RA患者的外周血及关节滑液中circ-AFF2表达水平与RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度均呈正相关（P<0.05），与滑膜血流分级、RI呈负相关（P<0.05）。RA患者外周血和关节滑液的circ-AFF2、RF均为RA的独立危险因素（P<0.05）。结论 RA患者外周血与关节滑液中的circ-AFF2表达水平均升高，且患者的疾病活动度越高，circ-AFF2表达水平越高。

[关键词] 类风湿关节炎；circ-AFF2；外周血；关节滑液；疾病活动度

[中图分类号] R593.22      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.15.005

Correlational study of circ-AFF2 expression level with disease activity in patients with rheumatoid arthritis

PING Tianhui

Department of Orthopedics and Traumatology， Huzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Huzhou 313000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of circ-AFF2 in peripheral blood and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis （RA） and its relationship with disease activity. Methods 90 patients with RA treated in Huzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine were included in RA group， and their clinical data and laboratory indicators were recorded. According to disease activity score-28 （DAS28）， the patients were divided into low-activity group （n=32）， medium-activity group （n=34） and high-activity group （n=24）; another 87 patients with joint injury were regarded as control group. The expression level of circ-AFF2 in peripheral blood and synovial fluid was determined by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） method， relevant laboratory indexes and ultrasonic indexes of knee joint were detected， and the research data were statistically analyzed. Results The expression level of circ-AFF2 in peripheral blood and synovial fluid of patients in RA group were significantly higher than that of control group （P<0.05）. The expression levels of circ-AFF2 in peripheral blood and synovial fluid， rheumatoid factor（RF）， erythrocyte sedimentation rate（ESR）， C-reactive protein（CRP）， anti-cyclic citrullinated peptide（CCP） and synovial thickness increased in turn （P<0.05）， while the synovial blood flow grading and synovial arterial resistance index （RI） decreased in turn （P<0.05）. The expression level of circ-AFF2 in peripheral blood and synovial fluid of patients with RA was positively correlated with RF， ESR， CRP， CCP， and synovial thickness （P<0.05）， and was negatively correlated with synovial blood flow grade and synovial artery RI （P<0.05）. Peripheral blood circ-AFF2， joint synovial fluid circ-AFF2， and RF were independent risk factors for patients with RA （P<0.05）. Conclusion The expression level of circ-AFF2 in peripheral blood and synovial fluid of patients with RA is increased， and the higher the disease activity of patients， the higher the expression level of circ-AFF2.

[Key words] Rheumatoid arthritis; circ-AFF2; Peripheral blood; Synovial fluid; Disease activity

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种多因素自身免疫性疾病，与关节的慢性炎症和关节破坏有关，其发病由异常调节性T细胞反应的诱导和进展决定[1-2]。随着疾病的发展，RA患者关节软骨和关节囊受到不同程度的损伤，最终导致关节畸形和功能丧失[3]。相关临床指标有助于医生更好地评估患者的疾病活动度，进而制订治疗计划。环状RNA（circular RNA，circRNA）是来自后剪接外显子或内含子的一种特殊RNA，在人类细胞基因表达调控中发挥关键作用[4]。临床中与RA相关的circRNA较多，其中circ-AFF2是由基因AFF2经反向剪接机制形成的共价闭合连续环，可影响转录后基因表达调控。研究显示，circ-AFF2在RA患者外周血中高表达，与疾病的发生、发展密切相关[5]。然而circ-AFF2与RA患者的疾病活动度相关的研究报道较少，本研究旨在探讨RA患者外周血和关节滑液中的circ-AFF2表达水平与疾病活动度的关系，现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

选取2019年12月至2022年4月于浙江中医药大学附属湖州中医院治疗的90例RA患者纳入RA组，其中男25例，女65例；年龄20～75岁，平均（50.16±6.81）岁。收集同期87例关节损伤患者纳入对照组，其中男29例，女58例；年龄20～73岁，平均（50.07±6.73）岁。纳入标准：①符合《2018中国类风湿关节炎诊疗指南》[6]中RA诊断标准；②年龄18～80岁；③入组前未服用过生物制剂、激素、免疫抑制剂或其他影响免疫功能及病情的药物；④RA和关节损伤患者均存在关节积液，且为膝关节损伤。排除标准：①合并股骨头坏死、强直性脊柱炎等其他关节疾病及系统性红斑狼疮、干燥综合征、原发性血小板紫癜等其他免疫性疾病者；②严重糖尿病、高脂血症、高血压或心脑血管疾病者；③有严重血液系统疾病、感染性疾病、内科疾病或代谢性疾病者。本研究经浙江中医药大学附属湖州中医院伦理委员会审批通过（伦理审批号：2020-011-01）。

1.2  方法

1.2.1  外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平检测  收集兩组患者入组后（治疗前）晨起空腹肘静脉血5ml，置于干燥离心管中分离血清；膝关节腔穿刺采集患者的关节滑液。采用Trizol总RNA提取试剂盒（上海圣尔生物科技有限公司，批号：SB-MR009）分离提取样品中总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度，反转录试剂盒（上海恒斐生物科技有限公司，批号：RP1105）进行反转录操作将RNA反转录为cDNA。采用美国Applied Biosystems公司的V115896型实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒进行扩增反应。qRT-PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，45次循环。反应以GAPDH为内参，反应结束后结果采用2–??CT法计算外周血与关节滑液的circ-AFF2相对表达量。

1.2.2  实验室指标采集  收集并记录患者的实验室指标，主要包括类风湿因子（rheumatoid factor，RF）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、抗环瓜氨酸肽（anti-cyclic cirtrullinated peptide，CCP）。参考Prevoo计算方式[7]计算RA疾病活动度评分（disease activity score-28，DAS28），DAS28=0.56×压痛关节数+0.28×肿胀关节数+0.7×ln（ESR）×1.08+0.16。根据DAS28-ESR将患者分为低活动度组32例（2.6分

1.2.3  超声检查  采用GE Voluson E8超声诊断仪，探头频率6～13.5MHz。患者取仰卧位，屈膝30°～45°，将超声探头纵向置于髌骨上端，观察并记录滑膜厚度和膝关节髌上囊积液。嘱患者尽量屈膝90°，将超声探头横向置于髌骨上端，观察并记录滑膜内彩色血流信号、滑膜血流分级、滑膜动脉阻力指数（resistance index，RI）。

1.3  观察指标

两组患者外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平、不同疾病活动度的RA患者外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平、各组患者的性别和年龄及RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度、滑膜血流分级、滑膜动脉RI。

1.4  统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行分析和处理，其中计数资料以例数（百分率）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验；计量资料检验后服从正态分布的以均数±标准差（）表示，组间采用独立样本t检验，三组间采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK法；RA患者外周血和关节滑液中的circ-AFF2水平与实验室指标的相关性采用Pearson相关分析；RA患者疾病活动度的影响因素采用多因素Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2  結果

2.1  两组患者外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平比较

RA组患者外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平均显著高于对照组（P<0.05），见表1。

2.2  不同疾病活动度RA患者外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平比较

高活动度组患者外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平均显著高于中活动度组和低活动度组（P<0.05）；中活动度组患者外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平均显著高于低活动度组（P<0.05），见表2。

2.3  不同疾病活动度RA患者的临床资料与实验室指标比较

三组患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。高活动度组患者的RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度均显著高于中活动度组和低活动度组（P<0.05），滑膜血流分级、滑膜动脉RI均显著低于中活动度组和低活动度组（P<0.05）；中活动度组患者的RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度均显著高于低活动度组（P<0.05），滑膜血流分级、滑膜动脉RI均显著低于低活动度组（P<0.05），见表3。

2.4  RA患者外周血和关节滑液的circ-AFF2表达水平与实验室指标的相关性分析

Pearson相关性分析结果显示，RA患者外周血和关节滑液的circ-AFF2表达水平与RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度均呈正相关（P<0.05），与滑膜血流分级、滑膜动脉RI均呈负相关（P<0.05），见表4。

2.5  RA患者疾病活动度影响因素的Logistic回归分析

以RA患者是否为高活动度为因变量，以外周血circ-AFF2、关节滑液circ-AFF2、RF、ESR、CRP、CCP、滑膜血流分级、滑膜厚度、滑膜动脉RI为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示，外周血circ-AFF2、关节滑液circ-AFF2、RF均为RA的独立危险因素（P<0.05），见表5。

3  讨论

RA的主要临床表现有关节僵硬、局部疼痛、受累关节周围组织肿胀等，其发病较缓慢，是一种外周关节的非特异性炎症综合征[8-9]。进入21世纪以来，人们对RA的病理生理机制及其治疗的理解显著提高，可早期诊断并强化治疗，通过定期测量疾病活动度进行密切监测[10-11]。

目前用于评估RA疾病活动度的方法主要包括DAS28、简化疾病活动指数、临床疾病活动指数、患者活动量表（patient activity scale，PAS）等，但这些评估方法均基于医生对疾病的主观或经验判断[12-13]。因此医生在评估疾病活动度时经常出现显著差异和异质性，可能会影响治疗计划的制定、临床期望及病情缓解。血液与关节滑液中相关生物指标的变化及其与RA的关系研究是目前临床研究热点，尤其是关节滑液中的指标情况更有利于反映局部病灶的变化[14]。本研究检测RA患者外周血与关节滑液中的circ-AFF2表达均上调，与Qu等[15]研究circ-AFF2在RA滑膜组织中的表达一致。Zhi等[16]通过细胞实验证实circ-AFF2在RA中表达失调可诱导RA患者成纤维样滑膜细胞的炎症反应。据此分析circ-AFF2表达上调对RA疾病发生可能起促进作用，且与其诱导炎症反应有关。此外，本研究结果中外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平随疾病活动度增加而升高。研究显示，RA疾病活动是慢性炎症发生、发展的过程，临床通过抑制circ-AFF2表达可有效控制炎症发生，是治疗RA的关键[17]。RF、ESR、CRP、CCP、滑膜厚度等实验室指标均是与RA密切相关的标志物，本研究中circ-AFF2与各实验室指标均显著相关，进一步提示circ-AFF2可能参与RA的炎症病理过程，在疾病活动度进程中发挥促进作用[18]。多因素分析结果显示，外周血与关节滑液的circ-AFF2表达水平是RA疾病高活动度的危险因素。分析可能原因：RA患者的circ-AFF2表达失调与体内免疫炎症失衡情况加重密切相关，而随着circ-AFF2释放入血和在关节滑液的表达水平增多，最终造成关节炎症及损伤的进一步加重。

综上，RA患者外周血与关节滑液的circ-AFF2均呈高表达，且其表达水平随疾病活动度增加而升高，是影响RA疾病活动度的重要因子。circ-AFF2有可能作为RA疾病活动度新的生物指标，其检测价值较高。

[参考文献][1] RIYADH-MOHSEN E， ALI N H， ALDAOSERI H A. Immunologic parameters for disease activity in rheumatoid arthritis[J]. Arch Razi Inst， 2021， 76（4）： 1095–1105.