响应面法优化风味蛋白酶水解低值河蟹的酶解工艺

符慧靖，李彦，于德阳，沈德熊，杨华，马俪珍，通信作者

响应面法优化风味蛋白酶水解低值河蟹的酶解工艺

符慧靖1，李彦1，于德阳1，沈德熊2，杨华1，马俪珍1，通信作者

（1. 天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300392；2. 可可溢香（江苏）味业有限公司，江苏 兴化 225700）

为制备蟹味浓郁的蟹味调味基料，以低值河蟹为研究对象进行高压浸提和酶解，固定高温高压温度（121 ℃）和时间（2.0 h），选择固液比（蟹泥与水的质量比）。风味蛋白酶酶解高压浸提液时，固定pH值为7.0，酶解温度为50 ℃，选择加酶量和酶解时间。以水解度、氨基酸转化率、蛋白质利用率为评价指标，对固液比、加酶量和酶解时间分别进行单因素试验，并在此基础上设计响应面优化试验。结果表明，固液比1∶4.0的条件下进行高压浸提，冷却后风味蛋白酶的添加量为0.25 %、酶解时间为2.0 h，在此条件下水解度为35.04%，酶解液表现出较强的蟹味。

低值河蟹；高压浸提；风味蛋白酶；酶解；水解度

河蟹，学名为“中华绒螯蟹”，俗称“螃 蟹”，是我国特有的淡水经济养殖品种，其营养全面，味道鲜美，经济价值较高[1]。河蟹富含蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素等营养成分，其中蛋白质含量是猪肉、鱼肉的几倍[2]。但由于加工技术和水平较低，目前我国河蟹加工制品品种单一、销售渠道受限，多以鲜活产品流通于市场[3]，导致一些个体较小或断肢残肢的低值河蟹在加工过程中无法得到有效利用，造成资源浪费及环境污染[4]。同时，河蟹在生产加工过程中会产生蟹腿、蟹壳等大量副产物，产品利用率和附加值低，也会造成环境污染[5]。河蟹在深加工方面尚未形成一个完整的产业体系，常见的河蟹加工制品有醉蟹、蟹肉罐头、蟹肉松等[6]。

酶解是制备水产调味基料的关键工序。蛋白质酶解是指蛋白质在酶的作用下降解成肽类以及小分子氨基酸的过程[7-8]，由于酶解反应具有过程温和、产物安全性高、无氨基酸破坏或无消旋现象发生等优点，且原料中有效成分保存完好，无有害物质产生，不会造成环境污染，因此常常将酶解技术应用于食品加工[9]。温建丰等[10]利用碱性蛋白酶对花蟹肉进行酶解，最适酶解工艺为：酶解时间3.2 h、温度51 ℃、pH 7.5，在此条件下得到的花蟹酶解液具有一定的抗氧化能力。XIAO等[11]采用复合蛋白酶对冷冻南美白对虾进行酶解，确定了最佳酶解条件，经过美拉德反应制得的虾酱香味浓郁。梁晓芳等[12]利用响应面法对虾夷扇贝进行生物蛋白酶优化酶解，得到了具有较高抗氧化能力的虾夷扇贝酶解液。洪瑶等[13]利用碱性蛋白酶酶解虾加工副产物，蛋白提取率为68.76%。郑捷等[14]等利用复合酶（风味蛋白酶与碱性蛋白酶比例为1∶1）酶解虾下脚料，并与各种辅料进行调配，制成的复合调味料香味浓郁，虾味鲜美。

本试验以低值河蟹为研究对象，经过高压浸提，添加风味蛋白酶进行酶解，以水解度、氨基酸转化率和蛋白质利用率为评价指标，通过单因素试验和响应面优化试验确定风味蛋白酶的最适酶解条件，为后续多酶复配工艺的研究提供前期研究基础，同时为工业化生产蟹味调味基料提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

低值河蟹：可可溢香（江苏）味业有限公司；风味蛋白酶（36 000 U/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；氢氧化钠、酚酞、甲醛（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2004精密分析天平：上海精科仪器公司；SX-500高压蒸汽灭菌锅：日本TOMY有限公司；THZ-98AB型恒温振荡器：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 低值河蟹高压浸提液的制备

将清洗后的低值河蟹（鲜活）放入沸水中烫漂3 min至外壳变红，取出沥干水分，用绞肉机绞碎两次成蟹泥（先用10 mm筛板，再用8 mm筛板）。将绞碎的蟹泥用自封袋包装（每袋100 g），放入速冻冰箱（-30 ℃）速冻1.0 h，然后置于-18 ℃冰箱中冷冻贮藏，备用。

以蟹泥为底物，按试验设计添加一定比例的清水，121 ℃高温高压浸提2.0 h，制成低值河蟹高压浸提液。

1.3.2 酶解工艺流程

低值河蟹高压浸提液→调节pH至7.0→预热至50 ℃→加酶（加酶量根据试验设计）→酶解（酶解温度为50 ℃，酶解时间根据试验设计）→灭酶（沸水浴10 min）→离心（4 000 r/min，15 min，2 ℃）→酶解液。

1.3.3 单因素试验设计

影响低值河蟹酶解的因素有固液比、加酶量及酶解时间，分别考察各因素对酶解效果的影响。

1.3.3.1 固液比对酶解效果的影响

按照1.3.1的方法制备高压浸提液，按照1.3.2的方法以高压浸提液为酶解底物，调节pH为7.0，酶解温度50 ℃，在加酶量0.20%、酶解时间3.0 h条件下，考察固液比（蟹泥∶水）（质量比）分别为1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0对酶解效果的影响，测定水解度、氨基酸转化率及蛋白质利用率。

1.3.3.2 加酶量对酶解效果的影响

按照1.3.2的方法，以高压浸提液为酶解底物，调节pH为7.0，酶解温度50 ℃，在固液比1∶3.0、酶解时间3.0 h条件下，考察加酶量分别为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30 %对酶解效果的影响，测定水解度、氨基酸转化率及蛋白质利用率。

1.3.3.3 酶解时间对酶解效果的影响

按照1.3.2的方法，以高压浸提液为酶解底物，调节pH为7.0，酶解温度50 ℃，在固液比1∶3.0、加酶量0.20%的条件下，考察酶解时间分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h对酶解效果的影响，测定水解度、氨基酸转化率及蛋白质利用率。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验结果，在水解度、氨基酸转化率、蛋白质利用率3个指标中，水解度的变化规律性较强，能更好地说明各因素对酶解效果的影响，因此以水解度为响应值，利用Design Expert软件设计3因素3水平试验，进一步对风味蛋白酶酶解蟹泥的固液比、加酶量、酶解时间进行优化。因素水平及编码如表1所示。

表1 响应面试验因素及水平编码值

因素固液比加酶量/%酶解时间/h -1011∶3.01∶3.51∶4.00.150.200.252.02.53.0

1.4 指标测定

氨基酸态氮含量的测定[15]：甲醛电位滴定法。

水解度的测定：

式中，：酶解液中氨基酸态氮含量，g/100mL；0：高压浸提液中氨基酸态氮含量，g/100mL；：高压浸提液中总氮含量，g/100mL。

氨基酸转化率的测定：

式中，：酶解液中氨基酸态氮含量，g/100mL；总：酶解液中总氮含量，g/100mL。

蛋白质利用率的测定：

1.5 数据处理

试验重复3次，结果用平均值±标准偏差表示。采用SPSS Statistics 21对数据进行差异显著性分析。响应面试验采用 Design-Expert 7.0 设计并进行结果分析，通过建立回归方程、绘制等高线和三维曲面图，对任意两种因素的交互效应进行分析评价。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 固液比对酶解效果的影响

在加酶量0.20%、酶解时间3.0 h条件下，固液比对酶解效果的影响如图1所示。由图1可以看出，固液比在（1∶2.0）～（1∶4.0）范围内，水解度及氨基酸转化率呈先上升后下降的趋势，在固液比为1∶3.5时达到最大值，水解度为28.94%，氨基酸转化率为24.40%。当固液比大于1∶3.5时，随着加水量的增大，底物浓度和酶的有效浓度均降低，不利于底物在溶解状态下与酶有效结合，酶解效果下降，这与侯小桢等[16]的研究结果一致。随着固液比的增大，蛋白质利用率呈直线下降趋势，固液比为1∶2.0时，蛋白质利用率最高，为24.12%，这一结果与王紫微[9]选用碱性蛋白酶酶解克氏原螯虾的结论一致。综合考虑，确定本试验的最佳固液比为1∶3.5。

图1 固液比对酶解效果的影响

注：不同小写英文字母表示显著性差异（＜0.05），下同

2.1.2 加酶量对酶解效果的影响

在固液比1∶3.5、酶解时间3.0 h条件下，加酶量对酶解效果的影响如图2所示。由图2可知，随着加酶量从0.10%增加至0.30%，水解度及氨基酸转化率整体呈上升趋势，但上升速率不同。加酶量在0.10%～0.20%范围内，水解度、氨基酸 转化率及蛋白质利用率均不断上升。当加酶量为0.20 %时，水解度达到30.55%，氨基酸转化率提高至24.91%，蛋白质利用率为15.63%。当加酶量为0.25%时，水解度和氨基酸转化率变化均不显著（＞0.05）。这是因为随着酶量的增加，酶与底物蛋白活性部位的结合也逐渐增多。当酶量增加至一定程度时，酶与底物蛋白活性部位达到平衡状态[17]，所以水解度变化不明显。但当加酶量为0.30%时，水解度明显增加，这可能是由于加酶量过高，产生了次级产物，蛋白质利用率明显增大。考虑到生产成本，最终确定本试验最佳加酶量为0.20%。

图2 加酶量对酶解效果的影响

2.1.3 酶解时间对酶解效果的影响

在固液比1∶3.5、加酶量0.2%条件下，酶解时间对酶解效果的影响如图3所示。由图3可知，随着酶解时间的延长，水解度呈先上升再趋于平缓最后下降的趋势。酶解时间为2.5 h时，水解度最大，为31.08%。在2.5～3.5 h范围内，随着酶解时间的延长，水解度变化不显著（＞0.05）。氨基酸转化率随酶解时间的延长整体呈上升趋势，酶解时间为3.0 h时，氨基酸转化率最高，达到23.86%，但随着酶解时间的延长，氨基酸转化率变化不显著（＞0.05）。蛋白质利用率变化趋势与水解度基本一致，酶解时间为2.5 h时，蛋白质利用率最高，达到16.96%，但随着酶解时间的延长，蛋白质利用率趋于平缓后逐渐下降。原因可能是在酶反应的初级阶段，酶解液中含有较多风味蛋白酶的作用位点，随着时间的推移，作用位点减少，水解速率降低，水解度增加缓慢[18]。此外，随着酶解时间的延长，酶解产物也逐渐增加，但当酶解产物增加到一定量时会反过来抑制风味蛋白酶的活性，从而使水解度保持相对平稳后有所下降[19]。结合实际生产中时间成本问题，确定最佳酶解时间为2.5 h。

图3 酶解时间对酶解效果的影响

2.2 Box-Behnken响应面试验优化酶解条件

在单因素试验基础上，使用Design- Expert 7.0软件，依据Box-Behnken中心组合试验设计原理设计响应面优化分析试验，研究固液比（）、加酶量（）、酶解时间（）3个因素对低值河蟹酶解效果的影响。从单因素分析结果来看，水解度的变化相对于氨基酸转化率和蛋白质利用率的变化更有规律性，能很好地反应风味蛋白酶对低值河蟹的水解情况，故选择水解度（）作为Box-Behnken响应面试验的考核指标。

2.2.1 响应面优化试验设计及结果分析

固液比（）、加酶量（）、酶解时间（）3个因素响应面中心组合试验设计及结果见表2。

表2 响应面中心组合试验设计及结果

试验号因素水解度/% 固液比加酶量/%酶解时间/h 13.00.152.522.99 24.00.152.527.59 33.00.252.527.95 44.00.252.533.90 53.00.202.025.25 64.00.202.035.62 73.00.203.027.50 84.00.203.029.89 93.50.152.026.26 103.50.252.034.30 113.50.153.027.87 123.50.253.030.54 133.50.202.531.08 143.50.202.531.62 153.50.202.530.54 163.50.202.530.01 173.50.202.531.08

注：表中固液比一列，3.0表示固液比为1∶3.0；3.5表示固液比为1∶3.5；4.0表示固液比为1∶4.0

利用Design-Expert 7.0软件对上述试验结果进行多元线性回归分析，建立水解度（）对固液比（）、加酶量（）、酶解时间（）的二次回归方程，即：＝30.87＋2.91＋2.75－0.70＋0.34－1.99－1.34－1.47A－1.29＋0.17C

对回归模型进行方差分析，结果如表3所示。由表3可知，回归模型＜0.000 1＜0.01，达极显著水平，说明风味蛋白酶对低值河蟹高压浸提、酶解效果所建立的模型显著回归；失拟项＝0.565 9＞0.05，不显著，说明所建立的回归模型拟合程度较高，能够真实地拟合响应面。相关系数R＝0.986 5，说明模型的回归效果较好，有98.65%的响应值可为建立的回归方程进行解释。由表3可知，因素、、、、A、B对酶解液水解度的影响极显著，因素对酶解液水解度的影响显著。此外，通过比较值，可看出3个因素对酶解效果影响的主次顺序为：固液比（）＞加酶量（）＞酶解时间（）。

表3 响应面试验回归模型方差分析

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性 模型 172.83 919.20 56.72＜0.000 1** A 67.92 167.92200.61＜0.000 1** B 60.39 160.39178.37＜0.000 1** C 3.96 1 3.96 11.700.011 1* AB 0.46 1 0.46 1.350.284 1 AC 15.92 115.92 47.020.000 2** BC 7.21 1 7.21 21.290.002 4** A2 9.07 1 9.0726.800.001 3** B2 7.01 1 7.01 20.710.002 6** C2 0.12 1 0.12 0.350.574 4 剩余项 2.37 7 0.34 失拟项 0.87 3 0.29 0.770.565 9 纯误差 1.50 4 0.37 总差175.20 16 相关系数R2＝0.986 5R2adj＝0.969 1

注：值是方差齐性检查的结果；**表示极显著水平（＜0.01）；*表示显著水平（0.01＜＜0.05）

2.2.2 响应面交互作用分析

为进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点，绘制响应面曲线图进行直观分析。3D图可以直观地分析各因素间的交互作用，响应面图为凸面图，弯曲度越大，等高线越接近椭圆形，表明两因素交互越显著，所建模拟方程有极大值[20]。

风味蛋白酶固液比与加酶量对水解度的影响如图4所示，随着固液比和加酶量的增大，水解度逐渐增大。但当固液比大于1∶3.5、加酶量大于0.20%时，水解度增长缓慢，考虑到生产成本，可得酶解优化条件为：固液比（1∶3.5）～（1∶3.75）、加酶量0.20%～0.23%。

固液比与酶解时间对水解度的影响如图5所示，随着固液比的增大，水解度逐渐增大。当固液比为1∶4.0时，水解度达到最大；随着酶解时间的增加，水解度变化不明显。因此可得酶解的优化条件为固液比1∶4.0。

风味蛋白酶加酶量与酶解时间对水解度的影响如图6所示，随着加酶量的增大，水解度逐渐增大，当加酶量为0.25%时，水解度达到最大。随着酶解时间的延长，水解度呈缓慢下降趋势。因此可得酶解的优化条件为加酶量0.25%、酶解时间2.0 h。

图4 固液比、加酶量对水解度的响应面图和等高线图

图5 固液比、酶解时间对水解度的响应面图和等高线图

图6 加酶量、酶解时间对水解度的响应面图和等高线图

2.2.3 验证性试验

由回归模型确定风味蛋白酶酶解低值河蟹高压浸提、酶解条件为：将固液比为1∶4.0的蟹泥液进行高温高压浸提（121 ℃，2.0 h），冷却后调节pH为7.0，添加0.25%的风味蛋白酶，在50 ℃温度条件下酶解2.0 h时，在此条件下水解度最高可达38.31%。采用上述优化过的酶解条件检验模型预测的准确性，试验重复3次，测得在此优化条件下水解度为35.04%，与预测值接近。

3 结论

本研究以低值河蟹为研究对象，进行高压浸提和酶解，固定高温高压的温度（121 ℃）和时间（2.0 h），选择固液比。风味蛋白酶酶解高压浸提液时，固定pH 7.0，酶解温度50 ℃，选择加酶量和酶解时间。在单因素试验结果基础上采用Box-Behnken中心组合试验设计，得到最佳条件为：固液比1∶4.0、加酶量0.25%、酶解时间2.0 h，在此条件下水解度为35.04%，蟹味浓郁。

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Optimization of enzymatic hydrolysis of low-value river crab by flavor protease with response surface methodology

Fu Huijing1, Li Yan1, Yu Deyang1, Shen Dexiong2, Yang Hua1, Ma Lizhen1,Corresponding Author

（1. College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Keke Yixiang（Jiangsu）Flavor Industry Co.Ltd., Xinghua 225700, Jiangsu Province, China）

In order to prepare crab flavor base material with strong crab flavor, this study took low-value river crabs as the research object, carried out high-pressure extraction and enzymatic hydrolysis, fixed high-temperature and high-pressure temperature（121 ℃）time（2.0 h）, and selected solid-liquid ratio（mass ratio of crab mud to water）. When the flavor protease was used to hydrolyze the high pressure extract, the pH was fixed at 7.0, the enzymolysis temperature was 50 ℃, and the enzyme dosage and enzymolysis time were selected. Taking hydrolysis degree, amino acid conversion rate and protein utilization rate as evaluation indexes, single factor experiments were carried out on solid-liquid ratio, enzyme dosage and enzymatic hydrolysis time, and response surface optimization experiments were designed on this basis. The results showed that the ratio of solid to liquid was 1∶4.0（mass ratio）, the amount of flavourzyme was 0.25% after cooling, and the hydrolysis time was 2.0 h. Under this condition, the hydrolysis degree was 35.04%, and the obtained hydrolysate showed strong crab flavor.

low-value river crabs; high pressure leaching; flavourzyme; enzymolysis; hydrolysis degree

1008-5394（2023）02-0031-07

10.19640/j.cnki.jtau.2023.02.007

TS201.1

A

2021-07-25

兴化市农业科技三项费用项目（无编号）；天津市淡水养殖产业技术体系创新团队—水产品加工岗位（ITTFRS2021000-012）

符慧靖（1997—），女，硕士在读，研究方向为水产品精深加工技术。E-mail：1849455113@qq.com。

马俪珍（1963—），女，教授，博士，研究方向为畜水产品加工品质与安全控制。E-mail：malizhen-6329@163.com。

责任编辑：宗淑萍