新疆南疆某规模肉牛场牛轮状病毒G6P[5]型基因型鉴定及分析

赵颖婕，张 伟，冷 婧，王宏图，胡建军*

（ 1. 塔里木大学兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆 阿拉尔 843300 ； 2. 塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300 ； 3. 阿克苏西域牧业发展有限责任公司，新疆 阿克苏 843000 ）

轮状病毒（BRV）属于呼肠孤病毒科，为轮状病毒属的双链RNA病毒[1]，是导致多种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一。犊牛感染后主要表现特征为腹泻、酸中毒、四肢无力、精神萎靡，腹泻严重时粪便中含有血丝和脱落的肠黏膜，其中1 周龄犊牛最易感，发病率高达90%~100%，对畜牧业造成严重危害。

轮状病毒属成员呈正二十面体对称，直径约75 nm，三层壳体，无囊膜，基因组由11个节段双股RNA组成。根据轮状病毒抗原关系和基因组RNA节段的PAGE电泳图谱，分为7 个种或血清型，即A~G。根据保护性抗原VP4 和VP7 的免疫原性和基因结构又可分为轮状病毒血清群分为P基因型和G基因型。A群感染力最强，危害最大；目前已知的G型有34个，P型有50个，国内为G6和G10流行株较多[2]，而且不同基因型之间交叉免疫保护性不强[3]。近年来，新疆南疆地区时有从其他地区大量引入奶牛或肉牛，犊牛腹泻成为规模化牛场、散养户常见的犊牛腹泻疾病。本试验旨在针对南疆某规模化牛场进行BRV分子流行病学调查，了解该地区BRV流行毒株的基因型，为规模牛场疫病防控剂疫苗研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

BRV检测试纸条（广州悦洋生物技术有限公司）、One Step RT-PCR Kit Ver.2.0试剂盒和RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）、反转录试剂盒（Thermo Scientific公司）、DMEM 培养基（西安米鼠生物科技有限公司）、MA104细胞（上海富衡生物科技有限公司）、胎牛血清（以色列生物工业有限公司）。

1.2 病料采集及处理

病料为采集自新疆南疆某规模化肉牛场的犊牛腹泻样本共5 份，经BRV 抗原检测卡检测，其中2 份确定为BRV阳性，-80 ℃冷冻保存。

1.3 引物设计

据参考文献[4]BRV 特异性引物基因序列，由上海派森诺公司合成，RT-PCR扩增引物见表1。

表1 RT-PCR扩增引物Tab.1 RT-PCR amplification primers

1.4 细胞培养

取细菌滤器处理的牛轮状病毒阳性样本上清液于37 ℃用胰蛋白酶处理30 min，并接种于致密单层的MA104 传代细胞，CO2细胞培养箱37 ℃培养2 h，每隔20 min，取出轻晃一次，最后加入10 mL 维持液，放入CO2培养箱中培养，接毒5 d后收毒，继续盲传4~5代，直到产生细胞病变（CPE）。

1.5 RNA提取

出现CPE的细胞培养液按照RNA提取试剂盒说明书操作，提取RNA于-80 ℃冰箱保存。

1.6 BRV的VP7、VP4基因鉴定

采用VP7-F 和VP7-R 的引物扩增蛋白全长基因，以第一次的RT-PCR产物作为第二次RT-PCR的模板，采用VP7-F 与G5-R、G6-R、G8-R、G9-R、G10-R 等引物进行多重半套式PCR 鉴定BRV 的G 型[3]；以VP4-F 和VP4-R特异性引物，扩增其蛋白基因，鉴定其P型。

扩增反应体系（25 μL）：Primescript 1 step Enzyme Mix 0.5 μL，VP7-F 0.5 μL，VP7-R 0.5 μL，模板RNA 2.5 μL，2×1 step Buffer 12.5 μL，RNase Free dH2O 8.5 μL；混匀后瞬时离心5 s。

反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃总延伸10 min。

取扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定[4]。目的条带纯化后送上海派森诺公司测序。

1.7 序列分析

测序序列在GenBank 中进行BLAST 比对分析，下载BRV 参考株的VP7、VP4 部分编码序列，通过DNASTAR、MEGA 生物软件对所测序基因序列与参考株进行核苷酸同源性比较，构建VP7、VP4部分基因系统进化树。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

将检测为阳性的样品接种到MA104 细胞，其中在第五代出现CPE，主要表现为细胞圆缩、集聚、脱落等。

2.2 RT-PCR鉴定结果（见图1~图3）

图1 BRV VP7基因RT-PCR扩增结果Fig.1 RT-PCR amplification results of BRV VP7 gene

由图1可知，对细胞培养液样本提取的RNA产物作为模板，用VP7-F 和VP7-R 作为引物，进行RT-PCR 检测，结果显示，扩增出1 062 bp的目的基因片段。

由图2 可知，以PCR 产物为模板，上游引物为VP7-F,下游引物分别为G5-R、G6-R、G8-R、G9-R、G10-R 进行半套式PCR，其中仅有引物VP7-F/G6-R 扩增出500 bp 大小的目的基因片段。

图2 BRV VP7基因G型鉴定Fig.2 G-type identification results of BRV VP7 gene positive samples

由图3可知，以VP4-F和VP4-R为引物扩增出842 bp大小的条带。

图3 BRV VP4基因P型鉴定Fig.3 P-type identification results of BRV VP4 gene positive samples

2.3 VP7、VP4基因核苷酸同源性分析（见图4~图7）

图4 BRV VP7基因核苷酸同源性比较Fig.4 Nucleotide homology comparison of BRV VP7 gene

由图4可知，通过DNAStar软件对所测序序列与NCBI中13个参考株VP7基因序列进行核苷酸同源性比较，所测序基因核苷酸序列与12个参考毒株的同源性高达90%以上[5]，与参考株MN928482（中国/2020，牛，MN928482.1）和MZ420184（韩国/2020，牛，MZ420184.1）参考株的核苷酸同源性为98.8%。

由图5可知，BRV VP7与MN928485（G6型）牛轮状病毒处于同一进化分支。确定该样本为G6 型牛轮状病毒，并命名为BRV-MGT-1。

图5 BRV VP7基因进化树分析Fig.5 Evolutionary tree analysis of BRV VP7 gene

由图6 可知，所测序序列与NCBI 中13 个参考株VP4基因序列的核苷酸同源性比较，样本核苷酸序列与13个参考毒株的同源性高达91%以上，与参考株MN937516（中国/2018，牛，MN937516.1）和MN937515（中国/2018，牛，MN937515.1）参考株的核苷酸同源性分别为97.7%和97.1%。

图6 BRV VP4基因核苷酸同源性比较Fig.6 Nucleotide homology comparison of BRV VP4 gene

由图7 可知，BRV-MGT-1 与P[5]型轮状病毒处于同一进化分支，并与MN937515（P5型）、MN937516（P5型）的核苷酸同源性为97.1%以上[6]。最终确定BRV-MGT-1为G6P[5]型轮状病毒。

图7 BRV VP4基因进化树分析Fig.7 Evolutionary tree analysis of BRV VP4 gene

3 讨论

近几年，新疆南疆地区从其他地区引入大批肉牛、奶牛。BRV是引起新生犊牛腹泻的重要病原之一，每年因犊牛腹泻造成严重的经济损失，成为困扰养牛业发展的重要因素。目前，国外流行的BRV 主要的基因型为G6 型、G8 型和G10 型，而我国主要流行G6 型和G10 型BRV[7]。国内多位学者报道了新疆地区牛感染BRV的情况，段新华等[8]对新疆4地区的7个牛场犊牛腹泻开展流行病学调查，结果表明为A 群BRV 感染。2018 年，陆亚冬等[9]以BRVVP6基因特异性引物，通过RT-PCR检测到新疆不同地区牛场犊牛存在BRV 感染，且BRV 阳性率较高，达72%。2008 年，常继涛等[3]报道，新疆部分奶牛场感染的BRV 为G10 型和G6 型。2016 年，张坤等[10]应用双抗体夹心ELISA、RT-PCR 的方法进行检测，结果发现，新疆部分地区犊牛感染BRV 的情况极为普遍。2019—2020 年，张迎春等[11]、崔鑫等[12]报道了新疆南疆部分规模牛场犊牛感染的BRV为G10型。

新生犊牛感染BRV所致腹泻很难通过临床诊断确诊，而根据BRVVP7和VP4的基因差异即可进行基因分型鉴定[13]。本研究通过对新疆南疆某规模肉牛场采集的犊牛腹泻粪便样品，经胶体金检测卡、RT-PCR 扩增VP7、VP4基因的方法进行分型鉴定[14]，确定BRV-MGT-1分离株为G6P[5]型BRV。此外，通过流行病学调查，该规模化肉牛场是新建场，部分牛曾从国内其他省份调入，该场BRV是国内其他地区引入还是当地传入还需进一步的流行病学调查。通过上述分析可知，新疆地区BRV以G10型、G6型基因型为主，与国内报道一致[11]，本研究结果也丰富了国内犊牛BRV分子流行病学数据库。

4 结论

目前，BRV呈现多样化流行趋势，BRV基因组在自然感染或试验条件下，可发生多宿主来源的基因重组现象。BRV既可以引起动物病毒性腹泻，也可感染人。病毒只要在人或动物群体中持续存在就可能导致BRV在易感动物群体中传播。此外，牲畜交易、调运移动可能导致BRV基因型分布发生变化。因此，对新疆当地犊牛腹泻开展BRV分子流行病学监测，有利于掌握BRV基因型变迁特征，为BRV疫苗研发提供参考。