马波沙星注射液在牛体内的生物等效性研究

贾 兴，王玉欣*，耿智霞，刘 静，瞿红颖，宋婷婷，郭李珉，邓彦宏

（ 1. 河北远征药业有限公司，河北 石家庄 050041 ；2. 河北省兽药技术创新中心，河北 石家庄 050041 ； 3. 吉林大学动物医学学院，吉林 长春 130000 ）

兽用喹诺酮类药物包括恩诺沙星、环丙沙星及氧氟沙星等，现广泛应用于养殖业，多用于治疗畜禽由细菌和支原体等引起的疾病，效果明显[1-3]。近年来，喹诺酮药物长期使用导致动物产生耐药性[4-6]。马波沙星作为第三代喹诺酮类抗菌药物，是动物专用喹诺酮类抗生素，具有抗菌谱广、活性强等特点，主要治疗由敏感菌引起的母猪子宫炎-乳腺炎-无乳综合征、牛呼吸道感染和牛泌乳期乳腺炎[7-9]。马波沙星抗菌谱广，对革兰氏阳性菌（特别是葡萄球菌属）、革兰氏阴性菌（大肠杆菌、多杀性巴斯德杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血性鲍特氏菌属等）及支原体有效[10]。研究表明，动物注射马波沙星吸收迅速且完全，血浆蛋白结合率低，在组织中分布广泛，消除半衰期长，生物利用度接近100%，无明显生殖毒性。本试验对两种马波沙星注射液在牛体内的药代动力学参数进行比较及生物等效性分析，为马波沙星注射液在兽医临床中的合理使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器

LC-16 高效液相色谱仪（岛津公司）、QUINTIX125D-1CN 电子天平（感量0.000 01 g，德国赛多利斯公司）、H1850R 台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、XW-80A旋涡混合器（其林贝尔仪器制造有限公司）、ZQZY-CF8轨道式摇床（上海知楚仪器有限公司）。

1.1.2 药品与试剂

受试马波沙星注射液（50 mL∶5 g），记为A；参比马波沙星注射液（100 mL∶10 g），记为R。

超纯水（密理博Milli-Q Academic 超纯水器）。马波沙星标准品（含量99.8%，批号H0801511），购自中国兽医药品监察所；氧氟沙星标准品（含量99.4%，批号0303-9613），购自中国兽医药品监察所。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国Sigma-aldrich公司。甲酸、乙酸、三乙胺均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验动物

本次临床试验以26头健康成年牛为受试靶动物，体重为600~800 kg，根据农业农村部指导原则设试验组与对照组两组，每组12头；另设2头空白不给药动物，能够满足法规要求。试验牛均由吉林省牧硕养殖有限公司提供。

1.2.2 试验设计

本试验采用单剂量双周期两处理随机交叉对照盲法设计。清洗期7 d。给药前，按随机数从小到大将试验牛分别标记1~24 号并分为两组，1~12 号为对照组，13~24 号为试验组。受试制剂A 与参比制剂R 均采用皮下给药方式单次给药，两种制剂的推荐给药剂量均为2 mg/kg，每日一次。由给药人员独立给药，1~12 号牛给药参比制剂R，7 d 后给受试制剂A；13~24 号牛给药受试制剂A，7 d 后给参比制剂R。

1.2.3 血样采集

在试验期内的不同时间点从牛的颈静脉采血10 mL，置于肝素抗凝采血管中，于-20 ℃保存。具体的采血时间点为：给药前一次（0 h）及给药后0.083、0.167、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500、2.000、3.000、4.000、6.000、9.000、12.000、16.000、24.000、36.000、48.000 h各一次。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：GL Science Inc C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相：pH值3.0、甲酸溶液∶水∶乙腈=76∶9∶15；检测波长：295 nm；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 µL。

1.2.5 方法学验证

对马波沙星标准品进行了方法特异性、稳定性、精密度、检测限和定量限及回收率试验，考察所建立方法的合理性。

1.2.6 血浆样品处理

血浆样品前处理方法参照梅雪洁等[11]的处理方法。从冰箱中取出血浆，解冻并混匀。精密量取0.5 mL样品到2 mL 离心管中，加入氧氟沙星标准液（内标溶液）振荡10 min。在4 ℃、15 000 r/min 离心10 min，吸取上清液过滤，精密量取样品溶液20 μL注入液相色谱仪进行检测。

1.3 数据统计与分析

采用Data Analysis System（DAS 3.0）软件对试验所得到的药代动力学参数进行分析，SPSS 软件对药动学参数进行生物等效性分析。

2 结果与分析

2.1 方法学试验结果

2.1.1 方法特异性

分析不同来源的空白样品，马波沙星和氧氟沙星（内标物）的保留时间附近无杂质干扰。马波沙星、氧氟沙星与血浆中其他组分分离良好，色谱峰保留时间分别约为9.4、11.2 min（见图1），方法特异性好。

图1 不同样品色谱图Fig.1 Chromatograms of different samples

2.1.2 定量限和检测限

以3 倍信噪比（S/N）为方法的检测限（LOD），测得试验牛血浆中马波沙星的LOD为0.05 mg/L。以10倍S/N为方法的定量限（LOQ），测得试验牛血浆中马波沙星的LOQ为0.10 mg/L。

2.1.3 线性范围

血浆中马波沙星HPLC 测定方法的结果表明，马波沙星在0.1~5.0 mg/L的浓度范围内时，方法的线性关系良好，得到标准曲线方程为y=0.998 384x+0.026 646 1，相关系数r=0.999 984 1，大于0.999。

2.1.4 精密度和回收率（见表1）

表1 牛血浆中马波沙星的回收率和精密度Tab.1 Recovery and precision of marbofloxacin in bovine plasma

检测结果表明，空白血浆中添加马波沙星在0.1~5.0 mg/L的浓度范围内，批内变异系数均小于3.51%，批间变异系数均小于7.18%，精密度良好。空白血浆中马波沙星的添加浓度为0.1、1.0、5.0 mg/L 时，回收率在92.27%~117.83%之间，回收率稳定。

2.1.5 稳定性

待测药物马波沙星在室温放置24 h 的响应值变异系数低于1.85%，前处理后8、16、24 h马波沙星响应值的变异系数均低于2.76%，反复冻融3 次后马波沙星响应值的变异系数低于6.76%，表明稳定性良好。

2.2 牛单剂量注射液A 和R 的实测血药浓度及药动学特征（见图2、表2）

表2 牛单剂量注射制剂A和R后的主要药动学参数Tab.2 Main pharmacokinetic parameters of cattle after single dose injection of preparation A and R

图2 牛单剂量注射马波沙星制剂A与R后血药浓度-时间曲线Fig.2 Blood concentration-time curve of cattle after single dose infusion of maploxacin preparation A and R

牛以2 mg/kg 剂量单次皮下注射马波沙星制剂A 和R后，不同时间测得的对应平均血药浓度-时间曲线见图2。

采用DAS 3.0软件药代动力学模块对获得的A和R的药-时数据进行非房室模型分析计算药动学参数，结果见表2。

2.3 生物等效性

采用DAS3.0 软件生物等效性模块，根据A 和R 的AUC0-t和AUC0-∞数据，对受试制剂A计算其相对生物利用度，计算结果为：马波沙星注射液AUC0-t和AUC0-∞的相对生物利用度为103.09%和104.60%；其中AUC0-t参数经生物等效性分析后，A 相比R 的90%置信区间范围为98.88%~108.31%，在规定范围内（80%~125%）；AUC0-∞参数经生物等效性分析后，90%置信区间范围为98.91%~110.15%，在规定范围内；Cmax参数经生物等效性分析后，90%范围为80.57%~121.42%，在规定范围内。

3 讨论

马波沙星动物专用的氟喹诺酮类抗菌药，主要通过抑制细菌脱氧核糖核酸回旋酶A 亚基的活性而抑制细菌DNA复制、转录及蛋白质的合成。由于马波沙星的抗菌机制特殊，因此与其他抗菌药很少产生交叉耐药性[12-13]。

EMEA报道，马波沙星经口服和注射给药后均可被很好地吸收，其Cmax和AUC值与剂量成正比；此外，马波沙星在几种动物体内分布广泛，除中枢神经系统外，在其他组织中的药物浓度均高于血浆，消除半衰期长，生物利用度高，生物利用度均可达到100%[14]。VMD 报道，马波沙星以2 mg/kg 体重的推荐剂量在牛皮下或肌内注射后，吸收迅速，并在不到1 h内最大血浆浓度达到1.5 mg/L，其生物利用度接近100%。马波沙星在犊牛体内消除速度较缓慢（消除半衰期为5~9 h），但在牛体内消除较快（消除半衰期为4~7 h）。通过对比表明，本试验得到的药代动力学数据与国外报道的数据相差不大。

4 结论

本研究结果表明，牛按照2 mg/kg 的剂量皮下注射马波沙星注射液的R 和A 后，两种制剂之间具有生物等效性，可认为两种制剂具有相似的临床疗效和临床安全性，均可应用于临床中牛相关疾病的治疗。