超声结合低浓度氯处理对即食蓝莓微生物多样性的干预作用

张洋洋，刘 聪，王嘉一

（邵阳学院食品与化学工程学院，湖南邵阳 422000）

蓝莓是杜鹃花科越橘属多年生低灌木类植物，果实中富含花青素和维生素C 等多种抗氧化成份[1]，具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎症、抗癌、保护心脏和软化血管等功能[2]，因营养丰富、风味独特而深受消费者喜爱。

即食果蔬是新鲜蔬菜和水果经清洗、修整、鲜切、杀菌、拼盘和包装等加工工序，消费者拆封即食的一种产品[3]。该类产品必须经过杀菌清洗，以减少表面微生物数量。超声波是一种物理非热杀菌技术，频率大于20 kHz时能引起空化作用以及力学、热学和化学效应，破坏微生物形态结构[4-5]。Limaye 等[6]使用1、3 MHz 超声波处理大肠杆菌和沙门氏菌，4 min 可灭活95.5%大肠杆菌，11.5 min可灭活95.5%沙门氏菌。此外，超声还能去除果蔬表面泥沙和污垢，是一种非化学去污手段，符合当下绿色环保的理念。许多研究也表明，栅栏技术杀菌效率高于单一消毒方法[7]。Johnson 等[8]发现超声可以增强抗生素对生物膜的清除效果，70 kHz 超声与庆大霉素联合处理2 h 能清除97%大肠杆菌生物膜；与红霉素结合后杀菌效果优于单一红霉素处理。Park 等[9]发现0.15%富马酸联合40 kHz超声，可显著降低苹果汁中大肠杆菌和沙门氏菌数量，优于单一消毒方法。

鲜切清洗过程中普遍使用含氯消毒剂来灭活表面微生物，但清洗水会导致交叉污染。因此，对清洗水中微生物灭活效果分析已引起学界重视。Haute 等[10]发现5 mg/L二氧化氯能完全灭杀水中的细菌、霉菌、酵母以及大肠杆菌；Gómez-López 等[11]发现7 mg/L 自由氯能有效灭杀清洗水中的大肠杆菌。此外，大量实践研究表明低浓度氯（10 mg/L 自由氯）对果蔬的杀菌效果与100～200 mg/L自由氯无显著性差异。因此，采用低频超声结合低浓度氯的方法既能有效控制成本，又能去污。前期实验发现，该组合能有效灭活蓝莓表面细菌、霉菌和酵母，且不对品质造成影响[12]，但作用机制却不明确。本研究采用测序技术分析了蓝莓贮藏过程（0～5 d、4 ℃）中细菌和真菌的多样性，以期从微生态角度对其作用机制予以解释。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

次氯酸钠、氢氧化钠、甲醇、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、盐酸、乙酸钠、醋酸钠、三氯乙酸，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

超声清洗机，28 kHz,洁盟清洗设备有限公司；液氮研磨机，A11,艾卡仪器设备有限公司；涡旋振荡器，VM-500Pro,群安实验仪器有限公司；pH 计，PHS-3E，上海仪电科学仪器有限公司；紫外分光光度计，NanoDrop NC200，Thermo Fisher Scientific,美国。

1.2 杀菌处理

新鲜蓝莓于实验当天购自邵阳湘西南水果批发市场。使用蓝莓匀浆制备洗涤水，化学需氧量调节至（250±10）mg/L，自由氯浓度调至10 mg/L。低浓度氯用次氯酸钠配制而成，清水为实验室自来水。超声参数为28 kHz和400 W，清洗3 min。第0 天清水处理组为CK0，超声结合低浓度氯处理组为T0；4 ℃贮藏第5 天，清水处理组为CK5，超声结合低浓度氯处理组为T5。

1.3 样本DNA 采集

将蓝莓表面微生物震荡至生理盐水中，使用灭菌的0.22 μm 滤膜截留细菌，随后装入无菌离心管中，并置于-80 ℃冻存待用。使用DNA 提取试剂盒（MP Biomedicals，美国）对滤膜上全DNA 进行提取，得到的DNA 使用紫外分光光度计进行定量，并使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。质量合格后将提取得到的DNA 在干冰条件下，进行送样分析。考虑到为环境样本，样本间差异较大，故共进行5 次生物学重复。

1.4 扩增与测序

对所提取DNA 的16S rRNA 中V3-V4 区进行扩增[13]，前引物名称为338F，前引物序列为ACTCCTACGG GAGGCAGCA，后引物名称为806R，后引物序列为GGACTACHVGGGTWTCTAAT，扩增片段长度480 bp；对提取的DNA 的ITS 进行扩增，前引物名称为ITS5F，前引物序列为GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG，后引物名称为ITS1R，后引物序列为GCTGCGTTCTTCATCGATGC，扩增片段长度250 bp。将真菌和细菌的PCR 产物送上海派森诺基因公司进行测序分析。

1.5 测序生物信息学分析

基于Illumina MiSeq 进行生物信息学分析。按照DADA2 方法[14]进行序列去噪，对各样本组在不同物种分类学水平的具体组成进行展示。根据特征序列（operational taxonomic unit，OTU）在不同样本中的分布，评估每个样本的Alpha 多样性水平，并通过稀疏曲线反映测序深度是否合适。

2 结果与分析

2.1 序列处理分析

稀疏曲线可反映样本测序深度。如图1 所示，曲线越平缓，表明测序数据量已足够，继续增加测序深度也无法检测到新的OTU。随着抽取序列的增加，真菌稀疏曲线在40 000 次时趋于平稳（图1A），细菌稀疏曲线在30 000 次时趋于平稳（图1B），说明测序量足以涵盖样品中的所有分类群。根据序列信息统计表（表1）结果显示，所有样本的输入（原始数据量）、过滤和降噪（有效序列量）数值接近，且单个重复样本测序通量均在九万条以上，足够全面反映样本的微生物多样性与群落组成状况。

表1 序列处理统计表Table 1 Sequence processing statistics

2.2 OTU 聚类分析

蓝莓表面真菌维恩图CVE 如图2A（见下页）所示，CK0、T0、CK5、T5 组的OTU 数量分别为110、166、180 和91 个，其中78 个OTU 为4 组共有。处理组贮藏5 d 后OTU 数量减少75，而对照增加70。蓝莓表面细菌Veen图见图2B，CK0、T0、CK5、T5 组的OTU 数量分别为5 761、2 510、3 522 和5 864 个，其中383 个OTU 为4 组共有。贮藏后处理组细菌OTU 数量增加3 354，而对照组减少2 239，与真菌观察结果相反。

图2 蓝莓表面真菌（A）和细菌（B）OTU 数量Veen 图Fig.2 Veen chart of OTU number of fungi (A) and baterial(B) present on blueberry

2.3 主坐标（principal co-ordinates analysis，PCoA）分析

使用距离矩阵（Bray-Curtis 距离）并结合主坐标分析将样本差异在低维度进行展示，以分析样本差异数据（距离矩阵）的比例。点距离越近表示在相应维度中的功能组成越相似[15]。真菌菌群结构主坐标分析如图3A 所示，真菌PC1 和PC2 主成分方差贡献率分别为57.4%和11.9%，表明处理组与对照组之间功能组成存在差异，贮藏5 d 后二者差异更为明显。而T5 组距离与T0 组距离较近，表明处理组在第5 天时与对照组功能组成无明显差异。细菌菌群结构主坐标分析如图3B 所示，PC1 和PC2 两个主成分方差贡献率分别为57.2%和15.4%。T5组距离与T0 组距离明显，表明处理组在第5 天时与对照组功能组成存在差异。

图3 蓝莓表面真菌（A）和细菌（B）菌群结构主坐标分析Fig.3 Principal coordinate analysis of fungi (A) and bacterial (B) community of blueberry

2.4 Alpha 多样性分析

Alpha 多样性反映微生物物种丰富度与多样性，Chao1 指数表征丰富度，Shannon 和Simpson 指数表征多样性[16]。图4A 显示处理组与对照组中真菌Chao1 指数、Shannon 指数和Simpson 指数无明显差异（P＞0.05），说明超声结合低浓度氯处理对蓝莓表面真菌菌落丰富度与多样性没有造成显著影响。图4B 表明T0 与T5 组Chao1 指数存在显著差异，处理组第5 天细菌丰富度显著高于处理组第0 天，而Shannon 和Simpson 指数均无明显差异，说明处理组在贮藏过程中细菌菌落丰富度显著增加而多样性无明显变化。

图4 蓝莓表面真菌（A）和细菌（B）Alpha 多样性指数图Fig.4 Alpha diversity index of fungi (A) and bacterial (B) on blueberry

2.5 真菌群落结构组成分析

蓝莓表面真菌的门水平分布如图5A 所示，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是优势菌门。部分子囊菌门可引起食品霉变和植物病变[17]。锈菌和黑粉菌等担子菌能导致严重的植物病害[18]。蓝莓表面子囊菌门和担子菌门相对丰度为82.50%和8.81%，处理后变为为73.67%和19.77%，说明该处理可能对子囊菌门灭活效果更为明显，使其相对丰度降低8.83%，而对担子菌门灭活效果较差，使其相对丰度升高10.96%。贮藏5 d后，对比T0 和T5 组，子囊菌门相对丰度在菌群中占比接近，说明处理组在贮藏期间子囊菌门相对丰度稳定，维持了较稳定的菌群结构。

图5 门（A）和属（B）水平真菌相对丰度分布图Fig.5 Relative abundance of fungi at phylum (A) and genus (B) level

以属等较高等级分类单元作为多样性的测量单位，能够较好地反映一个特定群落的生物多样性特征。蓝莓表面真菌属水平分布如图5B 所示，CK0 组的优势真菌属是曲霉属（Aspergillus）、赤霉属（Gibberella）、圆孢霉属（Staphylotrichum）、木耳属（Auricularia）和毕赤属（Pichia），分别占13.69%、6.80%、6.00%、4.45%和4.09%；T0 组的优势真菌属是木耳属、曲霉属、毕赤属、嗜热链球菌属（Mycothermus）和马拉色菌属（Malassezia），分别占13.49%、7.64%、6.91%、4.40%和3.22%。

在第0 天，杀菌处理使曲霉属、赤霉属和圆孢霉属相对丰度分别下降6.05%、6.36%和4.29%。曲霉属和圆孢霉属会引起果蔬腐败变质。赤霉属则大多是植物病源真菌[19]。说明该处理对曲霉属、赤霉属和圆孢霉属灭杀效果明显，使其相对丰度降低，而对木耳属和毕赤属灭杀效果较差，使其相对丰度上涨了9.06%和2.82%，进而解释了前期研究中发现的处理组中霉菌酵母计数在第0天低于对照组。

CK5 组的优势菌属是隐匿性菌属（Occultifur）、马拉色菌属、曲霉菌属、木耳属和哈萨克斯坦菌属（Kazachstania），分别占10.41%、9.07%、8.54%、6.22%和5.13%；T5 组的优势菌属是嗜热链球菌属、木耳属、哈萨克斯坦菌属、毕赤属和曲霉菌属，分别占14.28%、5.51%、5.50%、4.31%和2.75%。T5 组与T0 组比较，T5 组中嗜热链球菌属相对丰度上涨了9.88%。说明在第5 天，处理组通过降低其他菌属的相对丰度提高嗜热链球菌属的相对丰度，使蓝莓表面霉菌酵母计数低于对照组。

2.6 细菌群落结构组成分析

蓝莓表面细菌门水平分布如图6A 所示，变形杆菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿湾菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）是蓝莓表面的优势菌门，CK0 组中相对丰度分别为47.00%、19.38%、8.50%、8.14%和5.57%；T0组中相对丰度分别为46.97%、18.13%、9.34%、8.17%和8.08%；CK5 组中相对丰度分别为46.02%、20.63%、8.75%、8.30%和8.28%；T5 组中相对丰度分别为40.85%、31.70%、4.89%、7.83%和6.02%。变形杆菌在果蔬表面微生物群落组成中占比较高，其中不乏一些食源性致病菌，如沙门氏菌和大肠杆菌。

图6 门（A）和属（B）水平细菌相对丰度组成图Fig.6 Relative abundance of bacterial at phylum (A) and genus (B) level

蓝莓表面细菌属水平分布如图6B 所示，罗尔斯顿尼亚菌属（Ralstonia）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和乳杆菌属（Lactobacillus）是蓝莓表面属水平优势菌属。罗尔斯顿尼亚菌属能导致番茄、烟草、桑树等植物枯萎死亡，俗称“青枯病”[20]，是典型的土传病害，可在土壤、水体中存活长达5 年以上，防控难度极大[21]。鞘氨醇单胞菌属具有高效的代谢调控和基因调控能力，在促进植物生长等方面具有应用潜力[22]。乳杆菌属能够产生苯乳酸，具有防治果蔬真菌病害的作用[23]。罗尔斯顿尼亚菌属、鞘氨醇单胞菌属和乳杆菌属在CK0 组中的占比分别为20.66%、12.45%和5.39%，在T0 组中占比分别为20.23%、11.20%和7.81%，其相对丰度未发生明显变化。T5 组中三类菌属分别占18.50%、9.11%和10.23%。T5 与T0 对比发现，三类菌属相对丰度未发生明显变化，说明杀菌处理可能对三种微生物灭活效果一致，使蓝莓表面细菌组成保持在稳定水平，使杀菌处理后较低的菌落总数一直保持到贮藏末期，解释了前期研究观察到的实验结果，即处理组中菌落总数在0～5 d 一直低于对照组。

3 结论

为明晰超声结合低浓度氯对蓝莓天然菌群灭杀作用机理，本研究从微生态视角进行了分析，研究结论主要有：蓝莓表面优势细菌为罗尔斯顿尼亚菌属、鞘氨醇单胞菌属、乳杆菌属，杀菌处理对三种细菌相对丰度未产生影响；优势真菌为曲霉属、赤霉属、圆孢霉属、木耳属、毕赤属，杀菌处理后曲霉属相对丰度下降最明显，木耳属相对丰度升高最明显，嗜热链球菌属成为优势菌属；嗜热链球菌属在贮藏末期相对丰度最大，该菌可能通过抑制其它真菌生长以使处理组中霉菌酵母计数结果低于对照组。本研究也存在一定局限性，如测序深度问题，在未来的研究中将进一步采用宏基因组测序为菌群功能和种水平变化提供深度解析。