濒危植物水杉种子形态特征与种子活力关系

王建发，汤玉喜，唐 洁，黎 蕾，李永进

(1.临湘市荆竹山国有林场，湖南 临湘 414300； 2.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004)

林木种子的活力直接关系到苗木质量等级的高低、造林的成败以及能否实现林分速生、优质、高产、稳定的目标。高活力的林种具有明显的生长优势和生产潜力，对不利条件具有强大抵抗力[1-2]。除了遗传因素的主导作用外，很多因素能够改变种子的内部成分并影响种子的发芽和生存能力，其中种子形态、颜色、大小等生物学属性是重要的影响因子[3-4]。近年来，已有许多农产品基于图像成像检测方法探讨种子物理指标与种子活力的关系，通过算法应用现有数据的特征及其标签建立了优化合适的回归模型对种子活力进行检测与预测，这种种子无损检验避免了标准发芽测试、免疫分析测试等传统种子活力检测方法存在的操作繁琐、周期长、可重复性差等缺点[5-6]，可明显缩短分级时间和减少花费，并实现种子质量精准预测，对促进良种选育和提高植物生产力具有重要的现实意义[4，7-8]。

水杉(Metasequoiaglyptostroboides)是我国特有的珍稀濒危植物，被誉为植物中的“活化石”，具有生长迅速、树干挺直、树形优美、材性好和抗性强等特性，既是优质用材树种，又是绿化观赏、调蓄洪水、改善环境的优良树种，在发展经济和保护生态等方面发挥着重要作用[9-11]。由于长期受气候变化、人为干扰等因素影响，水杉原生生境遭到严重的破坏，目前现存水杉的原生种群仅分布于湖南、湖北、重庆三省市交界的利川、石柱、龙山三市县的狭窄区域。近年来，许多学者在水杉遗传特性、种群特征与环境关系、繁殖和栽培管理技术等方面进行了一些研究[12-18]。王思思[14]、陈文文[15]、张咏祀等[16]从分子角度研究了水杉遗传多样性；尤冬梅[17]、林勇等[12]开展了水杉种质资源地理分布、种子生物学特性等方面的研究，分析了水杉种子萌发困难、天然更新发生障碍的主要原因。种子活力及萌发能力作为植物有性繁殖的重要组成部分，在已有文献中关于种皮颜色、种子大小与种子活力关系的研究主要集中在小麦(Triticumaestivum)、青稞(Hordeumvulgarevar.nudum)、水稻(Oryzasativa)等农作物[19-27]，有关林木种子形态特征与种子活力关系的研究仅见云杉(Piceaasperata)、侧柏(Platycladusorientalis)、北沙柳(Salixpsammophila)等少数树种[28-30]，尤其关于水杉种子形态、大小与种子活力关系的研究尚未见报道。本研究以40株水杉原生古树的种子为试验材料，采用发芽试验和计算机图像识别相结合的方法，探讨水杉种子形态特征与种子活力的关系，为水杉种子无损分级和原生种群恢复提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2021年11月中下旬，在湖北省利川市选择40株水杉原生古树作为采种母株，树龄100～335 a，分株采集成熟球果并装入布袋带回湖南省林业科学院实验室，阴干。待球果果实室温风干开裂后，取出种子，密封后置于5 ℃冷藏室内，待用。采种母树基本情况见表1。

表1 水杉母树基本情况Tab.1Basic information of ancient Metasequoia glyp-tostroboides trees单株编号树龄/a树高/m胸径/cmLCXB33544.0 442.0LCGH-117040.0 269.0LCGH-210019.0 157.0LCGH-317528.0 296.0LCGH-411026.0 215.0LCGH-511029.0 206.0LCGH-610031.0 232.0LCGH-710029.0 247.0LCGH-811025.0 177.0LCGH-911024.0 183.0LCGH-1011022.0 231.0LCGH-1116043.0 268.0LCGH-1210026.0 234.0LCGH-1310028.0 260.0LCGH-1410028.0 198.0LCZL-110029.0 295.0LCZL-210036.0 267.0LCZL-310028.0 220.0LCZL-411036.0 278.0LCZL-510030.0 200.0LCZL-610033.0 265.0LCZL-710030.0 241.0 LCHS-111032.0 297.0 LCHS-215536.0 387.0 LCHS-315035.0 290.0 LCHS-412034.0 273.0

1.2 测定指标与方法

1.2.1 种子千粒重测定

采用百粒法测定种子千粒重。分别从每株水杉古树种子中随机取300粒种子，分成3 次重复，每个重复100 粒种子。用电子分析天平(精度0.001 g)对每份种子分别称重，然后取平均值计算种子千粒重。

1.2.2 种子形态测量

首先采用万深LA-S植物图像扫描仪对种子进行扫描，然后使用Photoshop CS6软件对所有种子的长度、宽度、投影面积、RGB值(R，红；G，绿；B，蓝)、HSB值(H，色相；S，饱和度；B，亮度，为与蓝色区分，下文用BHSB表示)、Lab值(L，亮度；a，从洋红色到绿色的范围；b，从黄色到蓝色的范围)、灰度等13个形态指标进行测量。每个单株测量6粒种子，每粒种子测量5个位点，计算其平均值。

1.2.3 种子活力的测定

先用0.3%的 KMnO4溶液对水杉种子进行消毒15 min，然后用蒸馏水冲洗干净，再用温水浸泡，待种子吸胀后，放入垫有滤纸的培养皿中，每皿 100粒，重复3次，并定期喷蒸馏水保持种子湿润。每24 h记录种子发芽情况。种子萌发的标准为胚根突破种皮，连续5 d无种子萌发时视为萌发结束[24-26]。发芽率(germination rate，GR)、发芽势(germination energy，GE)和发芽指数(germination index，GI)的计算公式分别为：

(1)

(2)

GI=∑Gt/Dt

(3)

式(1)～(3)中：GR为发芽率，GE为发芽势，GI为发芽指数，Gt为在不同发芽日(t日)的发芽种子数，Dt为对应的发芽日数。

1.3 数据分析

采用Excel 2010和SPSS Statistics 26.0软件进行数据整理与统计、相关性分析、主成分分析和逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 水杉种子萌发特征描述性统计分析

从表2可以看出，水杉样品种子平均发芽率为58.72%，平均发芽势为42.26%，平均发芽指数为12.78。各指标在不同树龄水杉间存在较大差异，变异系数介于24.80%～30.76%之间。不同树龄古树的同一萌发指标也存在较大差异，其中发芽指数的变异系数最大，变异系数达30.76%；发芽势的变异系数次之，为28.73%；发芽率的变异系数相对较小，为24.80%。

表2 水杉种子发芽特征及其变异Tab.2 Characteristics and variation of seed germination参数发芽率/%发芽势/%发芽指数最大值84.0071.0023.82最小值23.0016.004.65平均值58.72±14.5642.26±12.1412.78±3.93变异系数/%24.8028.7330.76

2.2 水杉种子物理指标描述性统计分析

40份水杉种子千粒重、长度、宽度、投影面积、R值、G值、B值、H值、S值、BHSB值、L值、a值、b值、灰度的平均值分别为3.26 g、5.55 mm、4.41 mm、17.52 mm2、146.92、100.25、51.60、29.77、66.35、57.60、46.64、17.22、34.38、69.94(表3)。此外，单株间水杉种子形态指标存在较大差异，其中B值的变异系数最大，为34.17%；b值的变异系数次之，为20.60%；长度的变异系数最小，为6.09%。总体而言，水杉种子的千粒重、投影面积和颜色指标的变异系数相对较大，而长度、宽度和灰度的变异系数相对较小，表明水杉种子的长度、宽度和灰度3个形态指标较为稳定。

2.3 物理指标与种子发芽指标相关性

基于Pearson相关系数法的水杉种子形态指标与发芽指标间的相关性分析见表4。从表4可以看出，发芽率、发芽势和发芽指数3个发芽指标之间呈极显著正相关。发芽率、发芽势和发芽指数与千粒重呈极显著正相关；发芽率与R值、B值、BHSB值，发芽势与R值、G值、BHSB值、L值均呈显著正相关；发芽率与投影面积、灰度，发芽势与灰度均呈显著负相关。形态指标间，千粒重与长度、宽度、投影面积，长度与宽度、投影面积，宽度与投影面积、灰度，投影面积与灰度，R值与G值、B值、BHSB值、L值，G值与B值、BHSB、L值，B值与BHSB值、L值，H值与S值、b值，S值与a值、b值、灰度，BHSB值与L值，a值与b值、灰度均呈极显著正相关；宽度与R值、G值、BHSB值、L值，投影面积与R值、G值、BHSB值、L值、b值，R值与S值、灰度，G值与S值、a值、灰度，B值与S值、a值、b值、灰度，H值与a值，S值与BHSB值、L值，BHSB值与灰度，L值与a值、灰度均呈极显著负相关；R值与b值，BHSB值与b值均呈显著正相关；宽度与b值，B值与H值均呈显著负相关。从整体来看，千粒重与发芽率、发芽势、发芽指数均存在极显著正相关，R值、G值、B值、BHSB值、L值、投影面积、灰度与发芽指标显著相关，其他指标与发芽指标无显著相关性。因此，从14个指标中筛选出千粒重(X1)、投影面积(X2)、R(X3)、G(X4)、B(X5)、BHSB(X6)、L(X7)和灰度(X8)等8个指标用于后面的统计分析。

2.4 主成分分析

从表5可以看出，KMO取样适切性量数为0.800，Bartlett球形度检验统计量P<0.001，表明各变量之间存在显著的相关性。从各公因子方差比可以看出，8个变量的提取量均达到70%以上，说明所有变量的信息提取比较充分；除千粒重、投影面积和B值外，其他5个指标信息提取量均达到90%以上，相对而言，各颜色指标信息提取量高于其他形态指标。

从表5中各主成分贡献率来看，水杉种子8个指标2个主成分(principal component，PC)的贡献率分别为72.359%、18.736%，累积贡献率达到了91.095%。其中，第一主成分(PC1)在R值、G值、B值、BHSB值、L值、灰度等颜色指标上具有较高荷载量，表明PC1中R值、G值、B值、灰度等6个颜色指标是主要因子；第二主成分(PC2)在千粒重和投影面积这2个指标上有较高荷载量，表明PC2中2个形状指标是主要因子。由于PC1、PC2基本包含了千粒重(X1)、投影面积(X2)、R(X3)、G(X4)、B(X5)、BHSB(X6)、L(X7)和灰度(X8)等8个指标所有信息，可以用2个变量A1、A2替代筛选出的8个单项指标，得出它们之间的线性关系(X1～X8为标准化值)，分别为：A1=-0.049 1X1-0.178 5X2+0.406 5X3+0.410 6X4+0.356 7X5+0.405 2X6+0.413 6X7-0.411 2X8，A2=0.736 1X1+0.639X2+0.002 5X3+0.066 3X4+0.191 5X5+0.007 2X6+0.049 3X7-0.073 7X8。

以2个主成分的贡献率为权重，构建综合评价模型F：F=0.723 6A1+0.177 4A2，代入数值后得出各株水杉古树种子的综合评价值F(表6)。

表6 综合评价值、发芽指标的实测值与预测值Tab.6 Measured and predicted values of F value and germination indexes单株编号F值发芽率/%发芽势/%发芽指数预测值实测值预测值实测值预测值实测值预测值实测值LCXB-2.83-2.7928.1427.2526.8325.006.216.12LCGH-1-4.31-4.2770.8171.2544.3046.0020.0920.27LCGH-2-1.49-1.4444.7443.0034.1435.0011.8411.35LCGH-3-2.72-2.6730.1228.1424.6120.336.576.13LCGH-40.630.6876.4975.9245.9947.3314.6114.91LCGH-5-2.25-2.2156.8057.2936.7440.3312.3112.59LCGH-60.370.4376.9775.4158.7663.0017.3018.31LCGH-7-1.26-1.2159.5858.8647.4545.0010.629.12LCGH-8-2.50-2.2546.7047.0136.1833.3312.3012.32LCGH-9-1.26-1.2057.7561.0346.2444.0010.539.04LCGH-10-1.31-1.1552.7451.1636.7435.6711.3710.56LCGH-113.022.0879.9080.6188.6263.0016.4416.50LCGH-121.351.4176.8174.9358.2860.0015.3315.82LCGH-131.231.4880.4781.3961.1764.0018.8918.80LCGH-14-1.55-1.5056.3353.0040.1234.6713.6613.86LCZL-11.631.7955.3753.4332.7728.6710.9410.14LCZL-20.510.5675.3972.3342.6347.0013.4514.75LCZL-3-0.83-0.7874.4071.3344.8546.6714.1113.87LCZL-4-0.45-0.6042.2540.6731.8728.339.949.23LCZL-5-0.66-0.5168.0362.0053.5250.3310.9211.93LCZL-6-0.78-0.7371.4570.7645.5942.6714.7714.56LCZL-7-0.010.0465.9668.6754.7453.0014.8215.00LCHS-10.520.6866.6170.5246.3545.6716.9216.74LCHS-2-2.67-2.6265.9767.2243.9143.3315.0615.36LCHS-3-0.65-0.6055.4359.8142.0842.0014.9915.60LCHS-40.410.4741.3444.1840.5036.007.398.38LCHS-50.240.3976.9973.8437.8140.0016.3817.12LCHS-62.332.4962.0862.1346.2948.6713.5614.69LCHS-72.332.3959.4258.2749.5351.0012.9513.71LCHS-82.052.1038.3336.0027.3425.677.977.24LCJY-12.232.2969.1370.9050.3249.6712.2211.33LCJY-21.241.1936.6735.6732.6629.335.945.49LCJY-3-0.19-0.2369.6468.6347.7451.0013.0114.63LCJY-42.642.6945.7941.1432.9830.007.327.88LCJY-51.781.8456.9651.8546.5545.0012.3512.87LCJY-61.861.9245.2045.4927.8028.6710.4410.26LCJY-7-0.52-0.4763.7160.9346.0551.3314.8914.03LCHH-10.360.4253.5050.6839.1335.3313.4913.95LCHH-2-0.34-0.2954.7952.6243.2941.0011.8410.98LCHH-31.871.9278.3674.4142.1443.3318.8519.15R20.9900.9730.8220.964

2.5 种子形态指数与活力指标回归模型

2.5.1 综合评价值与各因子的关系

基于逐步回归分析方法，建立综合评价值(YF)与千粒重(X1)、投影面积(X2)、R(X3)、G(X4)、B(X5)、BHSB(X6)、L(X7)和灰度(X8)等因子的回归方程：

YF=-10.057+0.178X1+0.007X2+0.026X3+

0.028X4-0.027X5+0.066X6+

0.072X7-0.079X8

(4)

(n=40,R=1.000**,R1=0.227**,R2=0.247**,R3=0.220**,R4=0.163**,R5=-0.012**,R6=0.247**,R7=0.182**,R8=-0.183**)

从式(4)中可以看出，8个影响综合评价值F的主要指标中，千粒重、投影面积、R值、G值、BHSB、L值均达极显著正相关，B值和灰度为极显著负相关，其预测值见表6。

2.5.2 发芽指标与各因素的关系

基于逐步回归分析方法，建立发芽率(YGR)、发芽势(YGE)和发芽指数(YGI)与千粒重(X1)、投影面积(X2)、R(X3)、G(X4)、B(X5)、BHSB(X6)、L(X7)和灰度(X8)等因子的数学模型：

YGR=51.480+19.843X1-3.283X2

(5)

(n=40，R=0.649**，R1=0.734**，R2=

-0.546**)

YGE=-41.514+10.035X1+1.075X3-

2.291X7

(6)

(n=40，R=0.540**，R1=0.444，R3=

1.205，R7=-0.968)

YGI=11.157+4.666X1-0.777X2

(7)

(n=40，R=0.636**，R1=0.637**，R2=

-0.480**)

从式(5)、(7)中可以看出，影响发芽率、发芽指数的主要指标为千粒重和投影面积；发芽率和发芽指数均与千粒重呈极显著正相关，与投影面积呈极显著负相关。从式(6)中可以看出，影响发芽势的主要指标为千粒重、R值、L值，且发芽势与千粒重、R值呈极显著正相关，与L值呈极显著负相关。同时，根据标准差误差检验，3个方程均通过了α=0.01水平的显著性检验，表明千粒重、投影面积、R值和L值对相应发芽指标的影响达到极显著水平。

从表6可以看出，综合评价指标F值、发芽率、发芽势、发芽指数的预测值和实测值呈极显著线性分布，且F值、发芽率、发芽势、发芽指数的预测值和真实值拟合度较高，R2分别为0.990、0.973、0.822和0.964，表明F值、发芽率、发芽势、发芽指数的预测值与实测值相差不大，其拟合模型可靠性较高。

3 结论与讨论

3.1 水杉种子形态与种子活力的关系

种子活力是判断种子质量的可靠指标。除遗传因素外，种子形态在一定程度上表征着种子活力。利用种子形态或物理指标结合图像处理技术对水杉种子形态特征与种子活力进行统计与方差分析，发现水杉种子间的种子颜色值和千粒重、投影面积的变异系数存在较大差异，且千粒重、R值、G值、B值、BHSB值、L值与各发芽指标呈极显著或显著正相关，投影面积、灰度与发芽指标存在显著负相关，表明千粒重较大、狭翅小、成熟度高的种子表现出更高的活力，这与张国盛等[30]、林玲等[28]对北沙柳、云杉种子的研究，刘振恒等[31]对青藏高原禾本科植物种子的研究，以及Vera[32]对石楠(Photiniaserratifolia)的研究结论一致。但时伟芳等[19]通过研究不同品种小麦发现千粒重、投影面积较小的小粒种子活力相对较低；Rezapour等[33]通过研究大、中、小粒的大豆(Glycinemax)种子发现，中粒种子的活力较高，但与大粒种子的发芽率没有显著差异。造成这种现象的原因是遗传因素、环境条件、萌发生理特点还是其他因素鲜有报道，机理也尚不清楚，还有待进一步研究。

3.2 水杉种子形态指标对种子活力的影响

主成分分析能降低所研究的数据空间的维数，同时保持数据集的对方差贡献最大的特征，但主成分分析并没有评价各指标对主成分的影响大小。逐步回归分析可对构成主成分的变量指标进行筛选，剔除多变量指标中一些不重要指标或共线性指标以获得最佳变量指标组合，是对主成分分析的有力补充。对水杉种子形态指标与种子活力进行主成分分析，表明颜色指标中的R值、G值、B值、BHSB值、L值、灰度特征向量最高，贡献率最高为72.359%，千粒重和投影面积等形态指标有较高特征向量，贡献率为18.736%，并且特征值均大于 1，已经保留了绝大部分重要信息，对原始多维数据具有较好的代表性，其中千粒重、R值、G值、B值、BHSB值、L值均达到极显著正相关，投影面积和灰度为极显著负相关。根据2个主成分建立形态指标与发芽指标间的逐步回归模型，结果显示千粒重、投影面积、R值和L值是影响发芽率、发芽势和发芽指数的主要因子，这是由于千粒重、投影面积和R值、L值代表着水杉种子的饱满程度和成熟度，千粒重和投影面积越大、种子颜色越深表示水杉种子内贮藏的营养物质越多和种子成熟度越高，水杉种子活力也就越高，这与时伟芳等[19]、邓贵仲等[20]、李贺勤等[24]的研究结果较为接近。本研究表明，千粒重、R值对种子活力的影响大于其他指标，千粒重和R值可作为水杉种子分级的参照指标。