苦荞黄酒发酵过程中功能性物质含量与体外抗氧化活性分析

李丹青，徐园若，成超超，孙明璐，包智敏，胡新中

（1.商洛学院，陕西商洛 726000；2.烟台南山学院，山东烟台 265713；3.陕西师范大学，陕西西安 710011）

苦荞麦，又名乌麦（Tartary Buckwheat），属蓼科荞麦属被子植物门双子叶植物，富含蛋白质、微量元素、生物类黄酮、矿物质、维生素等功能性物质，具有降“三高”、抗肿瘤、抗衰老、改善记忆力以及预防肥胖等功效，尤其黄酮和多酚类物质赋予了苦荞独特的保健功效和良好的抗氧化活性[1]。苦荞被国际粮农组织公认为药食同源特色杂粮作物，更是被《本草纲目》誉为“五谷之王”[2]。随着人民生活水平的提高，对营养与健康保健意识逐渐加强，以苦荞面为主要原材料的深加工食品进入公众视野，受到消费者青睐。苦荞中含有大量的支链淀粉，是用于发酵酿酒的理想原料[3]。黄酒是世界上最古老的传统酿造酒之一（已有4000 多年的历史），与葡萄酒、啤酒享有同样重要的地位，被誉为“国酒”和“液体蛋糕”，深受公众热爱[4]。在糯米中加入苦荞麦，经纯麦曲糖化发酵等系列工艺酿制而成的苦荞黄酒，具有特殊的保健功能，其低度、保健的特点，符合现代人的健康生活理念[5]。

近年来对苦荞的深加工研究主要集中在苦荞茶[6]、苦荞挂面[7]、荞麦酒等[8-9]，对苦荞黄酒的研究也多集中在加工工艺与风味成分等方面[10-12]，对发酵过程中的功能性物质动态监测研究较少。本试验以苦荞和糯米为主要原料，研究苦荞黄酒发酵过程中主要功能性物质含量和体外抗氧化活性的变化规律，以期为苦荞黄酒的功能挖掘和品质改善奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：糯米、苦荞，陕西商洛华润万家超市；黄酒酵母，安琪酵母股份有限公司。

试剂及耗材：糖化酶（食品级），河南万邦实业有限公司；没食子酸标品、芦丁标品、DPPH 标品、ABTS 标品（纯度均＞98%），北京索莱宝科技有限公司；福林酚，北京索莱宝科技有限公司；碳酸钠、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇、过硫酸钾、铁氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸（均为分析纯），上海国药集团化学试剂有限公司。

仪器设备：电子天平（AY-120），日本岛津公司；台式离心机（FCL-16），上海梓桂仪器有限公司；型电子恒温水浴锅（DXY-6），鼎鑫宜仪器有限公司；糖化锅（TL-B50），帅飞饮料机械有限公司；紫外可见分光光度计（721G-100），上海精科仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苦荞黄酒工艺流程及操作要点（图1）

图1 苦荞黄酒工艺流程

原料前处理：准确称取苦荞麦与糯米质量比为3∶5.5（g∶g）。将糯米淘洗干净，25 ℃左右的温开水浸泡10 h 后用蒸锅蒸30 min。将称量好的苦荞麦放于180 ℃的烘箱中进行烘烤，至苦荞麦出现焦香味后粉碎。

混合：将处理好的苦荞与糯米摊凉至50 ℃左右，加入苦荞与糯米质量总和的0.25%糖化酶和适量水进行混合，混合后将混合物放入糖化锅中糖化13 h。

加曲发酵：将糖化完成后的混合物转移至35 ℃恒温发酵箱中，接入苦荞与糯米质量总和的0.2%黄酒酵母进行发酵，发酵时间为12 d。

压榨、过滤、调配：发酵结束后压榨过滤，滤液静置2～4 d，使酒液澄清，加入适量焦糖色素调和酒体的颜色和口感[13]。

1.2.2 多酚含量测定

没食子酸标准液的配制：称取没食子酸1 g 加蒸馏水溶解，用500 mL 容量瓶定容，制得2 mg/mL的没食子酸标准溶液。

没食子酸标准曲线的制作：取洁净烧杯6 个按表1 进行操作，在725 nm 波长处测定吸光度，绘制没食子酸标准曲线[14]。

样品的测定：接种后开始每间隔24 h 取苦荞黄酒上清液3 mL，加入3 mL 福林酚试剂反应，5 min后加入3 mL 0.15 g/mL Na2CO3溶液，加蒸馏水至10 mL，25 ℃水浴避光反应15 min，使混合物在725 nm 处的吸光度不再发生改变，记录吸光度数值。

1.2.3 总黄酮含量测定

芦丁标准液的配制：称取芦丁标品0.20 g，加入42%乙醇加热使之溶解，放置常温后用1000 mL 容量瓶定容。制得浓度0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。

芦丁标准曲线的制作：取洁净烧杯6 个，按表2进行操作，在510 nm 波长处测定吸光度，绘制芦丁标准曲线[15]。

表2 芦丁标准曲线绘制

样品的测定：接种后开始每间隔24 h 取苦荞黄酒上清液10 mL，按上述步骤依次加入试剂后，加入42 %的乙醇定容至100 mL，充分反应使混合物在510 nm 处的吸光度值不再发生改变后记录吸光度数值，通过标准曲线计算黄酮类物质含量[16]。

1.2.4 DPPH自由基清除效果测定

DPPH 测试液的制备：称取50 mg DPPH，加无水乙醇超声振荡5 min 使其溶解，溶解后定容至1000 mL，制得0.05 mg/mL DPPH溶液。DPPH溶液应避光保存，3 h内用完[17]。

DPPH 自由基清除效果测定：接种后开始每间隔24 h 取5 mL 酒样加入到10 mL 0.05 mg/mL 的DPPH 自由基乙醇溶液中，室温放置35 min 使其充分反应，在517 nm 波长处测定吸光度值，按下列公式计算DPPH自由基清除率：

DPPH 自由基清除率(%)=[(1-A1)/A0]×100

式中：A1——含酒样样品的吸光度；

A0——空白对照组的吸光度。

1.2.5 ABTS自由基清除效果测定

ABTS 测试液的制备：量取50 mL 7 mmol/L 的ABTS 溶液和50 mL 2.45 mmol/L 的过硫酸钾溶液于烧杯中混匀，避光反应12 h，得到ABTS 自由基工作液。工作液应在2 h内用完。

ABTS 自由基清除效果测定：在80 μL 苦荞黄酒中加蒸馏水至4 mL，即体积分数为20 μL/mL。向其中加入4 mL ABTS溶液混合均匀，充分反应后在734 nm 重复测定3 次取平均值。以4 mL 纯净水和4 mL ABTS 混合液为对照组，ABTS 自由基清除率表示实验结果。从接种后开始每间隔24 h 取样测定一次，计算公式如下[18-19]：

ABTS 自由基清除率(%)=[(A0-Ax)/A0]×100

式中：Ax——样品反应10 min后测得的吸光度值；

A0——空白组的吸光度值。

1.2.6 ABTS还原能力测定

还原能力是评估酒体抗氧化能力的重要指标之一，该实验中苦荞黄酒发酵液先将体系中的Fe3+（铁氰化钾）还原成Fe2+（亚铁氰化钾），再与Fe3+（氯化铁）发生化学反应，形成亚铁氰化铁，使该混合液在700 nm 波长下的吸光度值增大，吸光度与被测样品的还原力呈正相关[20-22]。

250 μL酒样中加入1.5 mL蒸馏水，加入磷酸缓冲溶液4 mL，充分振荡使之混合均匀，加入3 mL 1%K3[Fe(CN)6]溶液加热到50 ℃反应25 min，加入3 mL 15 %的C2HCl3O2，3000 r/min 离心20 min，离心结束后进行抽滤，取抽滤液3 mL 于试管中，用移液枪向试管中加入3 mL 蒸馏水和1.5 mL 0.1 %的FeCl3溶液，充分反应后混合物在700 nm 处的吸光度不发生改变后记录吸光度数值。测定3 次取平均值，吸光度值越高表明被测物质的抗氧化性越强。从接种后开始每间隔24 h 取样1 次，进行测定[23-24]。

2 结果与分析

2.1 苦荞黄酒发酵过程中功能性物质含量的变化

2.1.1 没食子酸标准曲线

没食子酸回归线方程为y=0.1851x-0.5238，R2=0.9994。

图2 没食子酸标准曲线

2.1.2 苦荞黄酒发酵过程中多酚含量的变化

本实验分析了苦荞黄酒在发酵过程中多酚含量的变化规律，由图3 可知，苦荞黄酒发酵过程中多酚含量整体呈现先下降后升高并趋于稳定的趋势。发酵第1 天，多酚含量明显下降，苦荞黄酒刚开始发酵，发酵罐中存在大量的氧气，多酚发生了氧化反应或降解反应。当发酵罐中有足量的氧气时黄酒酵母进行有氧呼吸，使有机物完全分解，释放大量能量用于生长繁殖，当体系中的氧气被黄酒酵母消耗到一定量时，黄酒酵母在无氧条件下进行糖酵解生成酒精产生少量能量，苦荞和糯米中的多酚在醇类物质的作用下被不断地萃取出来；1～2 d，多酚含量变化不明显，被氧化的多酚和浸出的多酚达到动态平衡。2～8 d 多酚含量明显上升，随着发酵的不断进行，苦荞和糯米的细胞结构被破坏且体系中醇类物质不断积累，致使苦荞和糯米中的多酚被快速浸出，第8 天多酚含量达到最大含量195.57 mg/L；8～12 d 多酚含量差异不明显，呈现波动变化。

图3 苦荞黄酒发酵过程中多酚化合物含量的变化曲线

图4 芦丁标准曲线

2.1.3 芦丁标准曲线

芦丁回归线方程为y=11.393x+0.0014，R2=0.9993。

2.1.4 苦荞黄酒发酵过程中黄酮含量的变化

黄酮是自然界中广泛存在的天然有机化合物，相关研究表明黄酮具有抗氧化、清除自由基、改善血液循环、抗病毒和抗衰老、调节身体机能等作用[25]。黄酮的含量高低体现了苦荞黄酒的营养价值和保健功效。

本实验分析了苦荞黄酒在发酵过程中黄酮含量的变化规律，由图5 可知，0～8 d 苦荞黄酒发酵液中黄酮含量持续增加，在此过程中随着醇类物质的不断积累，苦荞和糯米中不溶于水或难溶于水的黄酮类物质溶解在醇类溶剂中，使体系中的总黄酮含量迅速增加，总黄酮含量在第9 天达到最大值，最大值为179.65 mg/L；9～12 d 总黄酮含量变化不明显，呈现波动变化，可能是由于发酵液中的多酚类物质和黄酮类化合物具有抑菌效果，抑制了黄酒酵母正常的生长代谢，致使体系中的酒精含量变化不明显，主发酵期间总黄酮和多酚含量随时间的延长而增加。从时间上看，多酚含量达到最大值的时间早于黄酮含量达到最大值的时间。

图5 苦荞黄酒发酵过程中黄酮含量的变化曲线

2.2 苦荞黄酒发酵过程中体外抗氧化活性的变化

2.2.1 苦荞黄酒发酵过程中DPPH 自由基清除率的变化

在苦荞黄酒发酵液中加入DPPH 醇溶液，苦荞黄酒发酵液与DPPH 发生化学反应，使得体系中DPPH 自由基被还原，DPPH 醇溶液黛紫色褪去，在517 nm处的吸光度减小。

本实验分析了苦荞黄酒在发酵过程中DPPH自由基清除率的变化规律，由图6 可知，第1 d 苦荞黄酒发酵液对DPPH 自由基的清除率有所下降，对比图3 可知造成对DPPH 自由基清除率下降的原因可能和此阶段多酚类物质的减少有关。1～8 d 时DPPH 自由基清除率明显上升，在第8 天时达到最大清除率93.59%，直到发酵后期，苦荞黄酒发酵液对DPPH 自由基的清除能力依然稳定在一个较高值，这可能与总酚和总黄酮在发酵后期含量保持相对稳定有关。

图6 苦荞黄酒发酵过程中DPPH自由基清除率的变化曲线

2.2.2 苦荞黄酒发酵过程中ABTS 自由基清除率的变化

ABTS 试剂与DPPH 相比，不仅可以溶于乙醇还溶于水，当其和氧化剂发生反应时，会被氧化成蓝绿色，在734 nm处有最大吸收峰[26]。把苦荞黄酒发酵液加入到被氧化的ABTS 自由基溶液，被氧化的ABTS 自由基溶液将会褪色且在734 nm 下的吸光度降低，吸光度值越小，苦荞黄酒发酵液的抗氧化能力越强。

本实验分析了苦荞黄酒在发酵过程中ABTS自由基清除率的变化规律，由图7 可知，0～3 d 时ABTS 自由基清除率不断缓慢增强，3～8 d 时ABTS 自由基清除率增长速度最快，第8 天时达到最大清除率65.31%，第9 天时ABTS 自由基清除率出现明显下降，可能与发酵时的气候、温度和发酵工艺等有关。

图7 苦荞黄酒发酵过程中ABTS自由基清除率的变化曲线

2.2.3 苦荞黄酒发酵过程中ABTS 还原能力的变化

本实验分析了苦荞黄酒在发酵过程中还原能力的变化规律，由图8 可知，随着发酵过程的不断进行，苦荞黄酒发酵液的还原能力不断增强，在0～8 d 期间增长速度最快，第8 天后慢慢趋于平稳，可能是前期功能性成分含量不断增加，使苦荞黄酒发酵液的还原能力增加，后期功能性物质含量趋于稳定，苦荞黄酒发酵液的还原能力也趋于稳定。在第8 天时，苦荞黄酒发酵液的还原能力是刚开始发酵时的5.5倍，还原能力较好。

图8 苦荞黄酒发酵过程中还原能力的变化曲线

3 结论

通过苦荞黄酒发酵过程中主要功能性物质含量和体外抗氧化活性规律来看，在发酵温度35 ℃、糖化时间13 h、黄酒酵母接种量为苦荞与糯米总质量的0.2 %、苦荞麦与糯米质量比为3∶5.5（g∶g）的工艺下，发酵过程能极大促进苦荞和糯米中的功能性物质溶出到苦荞黄酒中，到发酵第8 天左右，功能性物质含量和体外抗氧化能力趋于稳定，在一定范围内呈现波动变化趋势，多酚含量最大为195.57 mg/L，黄酮含量最大为179.65 mg/L，还原糖含量在后期一直处于缓慢下降状态，苦荞黄酒发酵液对DPPH 自由基清除效率最大为93.59 %，清除能力较强，苦荞黄酒对ABTS 自由基最大清除效率为65.31%，清除能力较弱，所以在苦荞黄酒主发酵进行到第8 天左右可以考虑停止其发酵过程。同时，研究发现苦荞黄酒在发酵前苦荞与糯米的预处理，对苦荞黄酒的品质也有重要影响。苦荞黄酒在发酵过程中，感官品质受多重因素影响，因此对苦荞黄酒的发酵工艺需进一步深入研究。