SIK1和miR-1273g-3p在结直肠癌细胞SW480中的表达及临床意义

刘大威,夏添明,武会斌,王云帅,孙生安,李朝辉

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化道疾病中常见不良恶性肿瘤中的一种,近年来结直肠癌的发病率逐渐上升[1]。因此,积极开展结直肠肿瘤的相关分子机制研究,寻找最新的特异性肿瘤分子标志物及治疗靶标,对患者进行早筛查、早干预以及改善预后具有重要的临床意义和社会价值。既往研究[2-3]显示,癌细胞释放的外泌体微小RNA-25(microRNA-25,miR-25)通过调控盐诱导激酶1(salt inducible kinase 1,SIK1)能够促进肝细胞癌的发生;miR-130b-3p能够通过靶向SIK1抑制髓母细胞瘤的发展。已有文献[4]报道miR-17通过下调SIK1促进人结直肠癌细胞增殖和迁移,miR-1273g-3p与FER1L4相互作用可抑制结直肠癌的转移[5]。本课题组前期研究[6]发现miR-1273g-3p能促进结直肠癌细胞的进展,但其与SIK1的关系仍未见报道。本研究旨在通过检测SIK1与miR-1273g-3p在结直肠癌细胞中的表达情况,分析其与结直肠癌患者的预后关系,为CRC的发病机制及预后影响因素提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月—2017年10月郑州大学附属洛阳中心医院接受手术治疗的CRC患者64例为研究对象,64例手术切除的结直肠癌患者的癌组织及对应癌旁组织作为标本。其中男性33例,女性31例;年龄35～84(61.66±10.68)岁。入选标准:(1)术前未接受放疗、化疗、免疫、靶向等抗肿瘤治疗的Ⅰ～Ⅳ期患者;(2)均首次诊断CRC并进行CRC手术,术后病理学证实为结直肠腺癌并资料完整;(3)年龄≦85岁;(4)未合并其他肿瘤或癌前病变,无直系亲属家族遗传史;(5)临床数据完整,并知情同意本次研究。排除标准:(1)多源性肿瘤患者;(2)术前或术后并发严重感染等影响预后者;(3)随访失访者。本研究已通过我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 主要试剂 人结直肠癌细胞株SW480、人结肠上皮细胞NCM460(卓越创新中心);miR-1273g-3p抑制剂及抑制对照组试剂(上海吉玛);兔抗人SIK1单克隆抗体购于武汉华美生物;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、超灵敏型ECL化学发光检测试剂盒、RIPA强效裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、PVDF膜、BeyoColorTM彩色预染蛋白分子量标准(碧云天);DAB显色试剂盒购于中国上海市长岛诊断试剂有限公司;DMEM培养基、胎牛血清(Sigma);LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent、Opti-MEMTM(Invitrogen);Trizol总RNA提取试剂盒、miR-1273g-3p引物和U6内参引物、聚合酶链反应相关试剂、反转录试剂盒(天根)。

1.3 细胞培养与转染 将NCM460和SW480细胞复苏后在含10% FBS的DMEM中于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养,取对数生长期细胞进行实验,取生长良好的SW480细胞用于转染。根据LipofectamineTM 2000说明书,将miR-1273g-3p抑制剂及阴性对照瞬时转染SW480细胞,在37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下继续培养。获得miR-1273g-3p低表达的结直肠癌细胞(抑制剂组)及相应对照(抑制剂对照组)。

1.4 qRT-PCR检测NCM460细胞株及转染前后SW480细胞株中miR-1273g-3p的表达水平 收集转染48 h后2组细胞,根据TRIzol试剂说明书提取细胞总RNA,根据miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒,FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂说明书分别逆转录获得cDNA。根据miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒、SuperReal 荧光定量预混试剂说明书用PCR仪进行扩增,检测各组miR-1273g-3p基因的表达水平并计算mRNA相对表达量。PCR反应均以U6为内参。引物序列见表1。实验结果采用 2-△△Ct法分析。

表1 引物序列

1.5 Western blot检测蛋白表达情况 Western blot检测SIK1及转染miR-1273g-3p抑制剂后表达情况。以细胞裂解液裂解提取各组细胞总蛋白,用BCA法测定蛋白含量,将蛋白质经30%聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转膜1.5 h,用5%脱脂牛奶密封2 h,加入一抗(兔抗人SIK1单克隆抗体,稀释比1∶1000),4 ℃过夜,TBST漂洗,加二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG,稀释比1:1000)室温孵育80 min,TBST漂洗,滴加发光试剂暗室曝光,显示条带。通过ImageJ软件对免疫反应条带进行量化分析。

1.6 免疫组织化学法(IHC)

1.6.1 检测SIK1蛋白表达水平 取手术切除结直肠癌组织及配对的癌旁正常组织标本(距癌组织边缘>5 cm),甲醛固定和石蜡包埋后,3 μm厚切片进行免疫组化。滴加SIK1一抗或一抗工作液(1∶500),冰箱4 ℃孵育过夜。PBS冲洗15 min,滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),SABC试剂覆盖切片,37 ℃下封闭20 min,PBS冲洗10 min;滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素,37 ℃孵育20 min。新鲜DAB适度染色,苏木精复染30 min,梯度乙醇脱水,中性树胶封片。以已有的阳性表达片作为对照组,以PBS代替一抗作阴性对照组。

1.6.2 免疫组化结果判读 每张切片在光镜200倍镜下随机观察,3个具有代表性的视野拍摄照片。采用半定量计分法评价免疫组化染色结果。染色程度:无染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。阳性范围:<5%为0分,5%～24%为1分,25%～50%为2分,51%～74%为3分,≥75%为4分。将上述2项评分相加作为最终评分结果:<6分为阴性,≥6分为阳性。

1.7 随访 通过电话和复诊病历进行随访,随访时间为3～72个月,中位随访时间为36个月,随访时间截至2021年1月31日。总生存期(overall survival,OS)定义为从手术次日开始,至任何原因死亡或随访结束的时间间隔。连续2次无法联系定义为失访,失访率为6.3%。

2 结果

2.1 miR-1273g-3p在NCM460和SW480细胞中的表达 qRT-PCR结果分析显示, miR-1273g-3p在SW480细胞中的表达水平高于NCM460细胞(P<0.01)(图1A)。转染miR-1273g-3p抑制剂后,在抑制剂对照组的相对表达量均值为0.93,而在抑制剂组的均值为0.08,miR-1273g-3p在SW480细胞中的表达水平低于对照组(图1B),差异具有统计学意义(P<0.0001)。

1A miR-1273g-3p在NCM460和SW480细胞中的表达1B 转染后miR-1273g-3p在SW480细胞中的表达 图1 qRT-PCR检测miR-1273g-3p在不同细胞中的表达水平

2.2 SIK1在NCM460和SW480细胞中表达 由免疫印迹条带图可知,SIK1在SW480细胞中的表达水平低于NCM460细胞(图2A)。SIK1在NCM460细胞中的相对表达量均值为0.61,而在SW480细胞中的均值为0.27(图2B),差异有统计学意义(P<0.0001)。

2A SIK1在NCM460和SW480细胞中的表达 2B NCM460和SW480细胞中SIK1的相对表达量比较图2 Western blot检测SIK1在不同细胞中的表达水平

2.3 结直肠癌细胞中 SIK1与miR-1273g-3p表达相关性 免疫印迹条带显示,SW480细胞中抑制miR-1273g-3p的表达后,SIK1表达升高,呈负相关性(图3A)。SIK1在抑制剂对照组的相对表达量均值为0.34,而在抑制剂组的表达均值为0.82(图3B),差异有统计学意义(P<0.0001)。

3A 抑制miR-1273g-3p表达后SIK1表达情况 3B 3组细胞中SIK1的相对表达量比较图3 Western blot检测转染miR-1273g-3p抑制剂的SW480细胞中SIK1的表达水平

2.4 SIK1在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达 SIK1在结直肠癌组织中的阳性表达率为65.6%(42/64),低于癌旁组织的82.8%(53/64),差异有统计学意义(χ2=4.940,P<0.026)。见图4。

4A 结直肠癌组织 4B 结直肠癌旁组织图4 免疫组化检测SIK1在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达(SP×200)

2.5 SIK1表达与结直肠癌患者临床病理特征间的关系 SIK1的表达与肿瘤大小、有无淋巴结转移、TNM分期密切相关,差异有统计学意义(P<0.05);而与性别、年龄大小、肿瘤生长部位、浸润深度、组织分化程度无关(P>0.05)。见表2。

表2 SIK1表达与CRC患者临床病理特征间关系

2.6 SIK1表达与患者生存期之间关系 Kaplan-Meier生存曲线显示,SIK1阳性表达组5年生存率为53.7%,高于阴性表达组的33.1%(图5),差异有统计学意义(χ2=5.367,P=0.021)。

图5 SIK1表达与患者生存期之间关系

2.7 预后影响因素分析 采用COX单因素回归分析各变量对CRC患者OS的影响,结果显示,SIK1表达情况、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期与CRC患者的OS存在相关性,而性别、年龄大小、肿瘤生长部位、浸润深度、组织分化程度与患者的OS无关。将单因素分析中有意义的指标纳入Cox回归模型进行多因素分析显示,SIK1的低表达和TNM高分期是影响OS的独立危险因素。见表3,表4。

表3 影响CRC患者OS的单因素分析

表4 影响CRC患者OS的Cox回归分析

3 讨论

CRC是全球第三大常见癌症死亡原因,每年有超过885万病例死亡,在新诊断的结直肠癌中,20%的患者合并有转移,另外25%表现为局部疾病的患者后来会发展为转移性疾病[7]。因此,在分子基因水平上开展CRC的研究有助于提高CRC患者的诊治水平。

miRNA是一种由18～24个核苷酸所组成的小分子非编码RNA,不含开放阅读框,也不经由翻译途径生成蛋白质,但是有调控蛋白编码基因活性的功能[4]。miR-1273g-3p编码在位于1号染色体上的SCP2基因内含子中,共有1330个结合位点[8]。研究[9]表明,miR-1273g-3p在乳腺癌组织和细胞中呈高表达,能够作为早期乳腺导管癌诊断的新的生物标志物。在乳腺癌骨转移的过程中,小核仁RNA宿主基因3(small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3)通过外泌体miR-1273g-3p正向调控骨形态发生蛋白3(bone morphogenetic protein 3,BMP3)的表达[10]。在胰腺癌中,miR-1273g-3p和miR-6126明显过表达,与CA 19-9水平变化趋势一致,与单独检测CA 19-9相比,miR-1273g-3p联合CA 19-9的血浆水平在区分胰腺癌患者与健康受试者方面表现出更强的能力,敏感性和阴性预测值都有所提高[11]。另有研究[12]显示,miR-1273g-3p能够通过调控受体蛋白酪氨酸激酶erbB-4(ErbB2 receptor tyrosine kinase 4,ERBB4)/磷脂酰肌醇3-激酶调节亚基γ(phosphoinositide3kinase regulatory subunit 3,PIK3R3)/雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)/核糖体蛋白S6激酶2(S6 kinase 2,S6K2)信号通路促进结直肠癌的进展。本研究通过qRT-PCR检测发现miR-1273g-3p在结直肠癌细胞中高表达,转染抑制剂后其表达低于对照组,与既往研究结果一致。进一步通过免疫印迹实验发现,在抑制了miR-1273g-3p表达的结直肠癌细胞中,SIK1的表达升高,提示miR-1273g-3p与SIK1在结直肠癌细胞中呈负相关,二者可能共同参与了结直肠癌的发生、发展,为后期详细的机制研究奠定了基础。

SIK1是SIK家族成员之一,在消化道癌症的产生和进程中发挥了关键性作用[13]。Hartono等[14]研究表明,沉默SIK1导致促纤维增生性小圆细胞瘤(desmoplastic small round cell tumor,DSRCT)细胞DNA复制的停止和体内肿瘤生长的抑制。Wang等[15]在骨肉瘤细胞中的研究显示,SIK1能抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移。在宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)中,长链非编码RNA核受体亚家族2F组成员1-反义RNA 1(LncRNA NR2F1-AS1,NR2F1-AS1)通过调控miR-17/SIK1轴抑制了CSCC细胞的侵袭和迁移[16]。而在胃、甲状腺、乳腺癌等肿瘤中同样起着重要作用[17-20]。在本研究中,SIK1在结直肠癌细胞中低表达,进一步通过免疫组化检测64例结直肠癌组织样本中SIK1的表达情况发现,其阳性表达率为65.6%,低于癌旁组织的82.8%,说明SIK1可能在结直肠癌中表现出抑癌的作用。通过分析临床病理特征发现,SIK1表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期密切相关。此外,对结直肠癌患者5年生存期的影响分析显示,阳性表达SIK1组患者的5年生存期明显高于阴性组,表明SIK1的高表达抑制了肿瘤细胞的增殖、分化,从而抑制淋巴结转移等,表现出较好的预后。在单因素分析中,SIK1表达情况、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期与CRC患者的OS有关,把单因素分析中有重要统计学价值的变量纳入Cox多因素回归模型进行风险因素分析,结果显示SIK1的低表达和TNM的高分期是影响OS的独立危险因素。进一步验证了SIK1在结直肠癌诊治中的地位,突出了其重要性。

综上所述,本研究发现SIK1与miR-1273g-3p在结直肠癌细胞中表达呈负相关性。SIK1在结直肠癌患者中的表达较低,并且与患者的生存期、肿块大小、淋巴结有无转移、TNM分期具有相关性,是影响结直肠癌患者OS的危险因素。这一结论提示miR-1273g-3p可能通过调控SIK1的表达来促进结直肠癌的发生发展,二者有望成为新的癌症治疗靶点。但其具体调节机制,仍需进一步探索。