高黏液型肺炎克雷伯菌毒力基因及临床特征分析*

江培涛,方 敏,马 超

南京鼓楼医院集团仪征医院/扬州大学医学院附属医院检验科,江苏扬州 211900

肺炎克雷伯菌(KP)是临床常见的革兰阴性条件致病菌,可以引起呼吸道、尿道、血流等多处感染。近年来由肺炎克雷伯菌导致的肝脓肿病例不断出现[1],高毒力肺炎克雷伯菌逐渐引起人们关注。高黏液型是高毒力肺炎克雷伯菌的主要生物学特性之一,但有研究认为不能将高黏液型和临床高毒力肺炎克雷伯菌划等号[2]。本研究拟从高黏液型肺炎克雷伯菌的毒力基因表达和其感染病例的临床特征入手,探讨高黏液型肺炎克雷伯菌感染的临床特征及毒力基因的表达情况,现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 选择2018年7月至2022年5月南京鼓楼医院集团仪征医院门诊和住院患者临床分离的154株肺炎克雷伯菌为研究对象,剔除同一患者相同部位的重复分离菌株。标本科室来源:呼吸内科36株,神经外科31株,ICU 30株,心胸外科18株,心血管内科8株,儿科8株,普外科5株,其他科室18株;标本类型:痰及肺泡灌洗液118株,尿液21株,脓液及伤口分泌物10株,血液3株,导管2株。所有菌株的鉴定均通过PCR实验检测rpoB基因(rpoB-F:5′-CGTATCGTAAAGTGACCGACG-3′;rpoB-R:5′-GGCCGTTTTCATCCAGGTTG-3′)[3]进行确认。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603,均购自法国生物梅里埃公司。

1.2主要仪器与试剂 GHP-9270数显隔水式恒温孵育箱(上海精宏医疗器械厂);MicroScan WalkAway 96 Plus 细菌鉴定药敏分析仪(美国贝克曼公司);TGL-18R冷冻高速离心机(珠海Hema医学仪器有限公司);NanoDrop2000分光光度计(美国Thermo公司);ABI7500PCR仪(美国ABI公司);细菌基因组提取、PCR检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司);琼脂糖(广州赛国生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1菌株药敏试验 所有菌株药敏试验(微量肉汤稀释法)均由MicroScan WalkAway 96 Plus 系统完成。药敏试验判断标准参照2018版CLSI M100执行。

1.3.2高黏液型鉴别 根据拉丝试验[4],用接种环挑取血平板上的菌落,以黏液丝长度大于5 mm的肺炎克雷伯菌为高黏液型菌株,将154株肺炎克雷伯菌分为高黏液型和非高黏液型。

1.3.3临床资料信息采集 通过实验室信息系统(LIS)和医院信息管理系统(HIS)获取154株肺炎克雷伯菌感染病例的实验室检测结果及年龄、性别、体温、诊断等信息,其中实验室检测结果和体温数据以该菌株培养标本送检当天或2 d内最近一次结果为准。

1.3.4毒力基因的检测 采用实时PCR方法检测毒力基因[黏液表型调节基因A (rmpA)、rmpA2、黏液相关基因A(magA)、气杆菌素铁载体基因(aerobactin)]的表达。基因引物序列rmpA-F:3′ACTGGGCTACCTCTGCTTC-5′;rmpA-R:3′-CTTGCATGAGCCAT CTTTCA-5′;rmpA2-F:3′-TGTGCAATAAGGATGTTACATTAGT-5′;rmpA2-R:3′-TTTGATGTGCACC ATTTTTCA-5′;magA-F:3′-GGTGCTCTTTACA TCATTGC-5′;magA-R:3′-GCAATGGCCATTTGCGTTAG-5′;aerobactin-F:3′-GCATAGGCGGA TACGAACAT-5′;AEROBACTIN-R:3′-CACAGGG CAATTGCTTACCT-5[4-8]。用TRIzol法提取总RNA并将其水平调整到150 ng/mL。按试剂盒说明书使用反转录试剂将RNA反转录后对靶基因进行测定。

1.4统计学处理 采用Whonet5.6软件进行抗菌药物敏感性统计;采用SPSS20.0软件进行数据分析。计数资料以例数、百分率表示,比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1高黏液型鉴别结果 根据拉丝试验,154株肺炎克雷伯菌分为高黏液型69株和非高黏液型85株。

2.2药敏试验 除氨苄西林(氨苄西林为固有耐药)及妥布霉素外,高黏液型菌株对其他抗菌药物的耐药率均明显低于非高黏液型(P<0.05)。高黏液型菌株检出产超广谱β-内酰胺酶菌株3株(4.35%),非高黏液型菌株检出产超广谱β-内酰胺酶菌株6株(7.06%),二者产超广谱β-内酰胺酶菌株检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。高黏液型菌株检出碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌(CRE)8株(11.59%),非高黏液型菌株检出CRE 28株(32.94%),二者CRE检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05);高黏液型菌株检出广泛耐药肺炎克雷伯菌(XDR-KP)9株(13.04%),非高黏液型菌株检出XDR-KP 25株(29.41%),二者差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 高黏液型和非高黏液型肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的耐药性[n(%)]

2.3肺炎克雷伯菌感染病例临床特点及实验室指标结果 高黏液型菌株和非高黏液型菌株感染者性别、年龄、白细胞计数、超敏C反应蛋白和科室分布情况比较,差异均无统计学意义(P>0.05),但高黏液型菌株感染者中体温>37.2 ℃和中性粒细胞百分比>70%的比例高于非高黏液型菌株感染者(P<0.05),高黏液型菌株在呼吸道感染患者的检出构成比高于非高黏液型菌株(P<0.05),高黏液型菌株在泌尿系统感染患者的检出构成比却低于非高黏液型菌株(P<0.05)。见表2。

表2 高黏液型和非高黏液型肺炎克雷伯菌感染病例临床特点及实验室指标结果[n(%)]

2.4肺炎克雷伯菌毒力基因的携带情况 高黏液型和非高黏液型肺炎克雷伯菌rmpA、rmpA2、aerobactin 3种毒力基因的携带率比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而magA毒力基因的携带率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 高黏液型和非高黏液型肺炎克雷伯菌毒力基因的携带情况[n(%)]

3 讨 论

肺炎克雷伯菌广泛分布于自然界,其肺炎亚种可引起重症肺炎、支气管炎及各种肺外感染。其中高毒力肺炎克雷伯菌是社区获得性肝脓肿、坏死性筋膜炎及眼内炎的重要原因。但目前区分高毒力肺炎克雷伯菌和经典克雷伯菌主要依赖于拉丝试验,但该试验的灵敏度和特异度尚无定论,更好的高毒力肺炎克雷伯菌诊断试验仍有待开发。

本研究中,除氨苄西林和妥布霉素外,高黏液型菌株对其他抗菌药物的耐药性均明显低于非高黏液型菌株,差异均有统计学意义(P<0.05)。对于肺炎克雷伯菌而言,氨苄西林为天然耐药,而妥布霉素在临床主要用于革兰阴性杆菌及葡萄球菌感染,特别是用于对庆大霉素耐药的革兰阴性杆菌的治疗,但因其对听神经和肾脏功能的损害等不良反应,限制了其在临床的应用,故本研究中高黏液型与非高黏液型菌株对妥布霉素的耐药率均较低(<20.00%)。而对于阿米卡星和庆大霉素这两种常用的氨基糖苷类及氟喹诺酮类抗菌药物,高黏液型与非高黏液型菌株的总体耐药率与中国细菌耐药监测网(CHINET)所报道的近几年全国数据[9]相近。对于临床常用的第3代头孢菌素及碳青霉烯类抗菌药物,本研究中非高黏液型菌株耐药率与CHINET数据相近,而高黏液型菌株耐药率则远低于全国数据,这与地区差异及全国数据统计时并不区分是否高黏液型有关。本研究在高黏液型菌株中检出8株CRE,而非高黏液型菌株中检出28株,两组之间CRE检出率比较,差异有统计学意义(P<0.05),高黏液型菌株的CRE检出率明显低于非高黏液型菌株,而且CRE菌株也均表现为广泛耐药。

本研究除了比较高黏液型与非高黏液型菌株耐药性差异之外,进一步分析其临床病例特点及实验室检测数据,结果发现,高黏液型菌株和非高黏液型菌株感染者性别、年龄、白细胞计数、超敏C反应蛋白和科室分布情况比较,差异均无统计学意义(P>0.05),但高黏液型菌株感染者中体温>37.2 ℃和中性粒细胞百分比>70%的比例均高于非高黏液型菌株(P<0.05)。这说明本研究中高黏液型菌株的毒力总体上强于非高黏液型,但仍有20%左右的高黏液型菌株不具有这些特征,因而不能把菌株的高黏液表型完全等同于高毒力。就感染部位而言,高黏液型菌株和非高黏液型菌株检出构成比最高的均为呼吸道,其次为泌尿系统。但高黏液型菌株在呼吸道感染患者的检出构成比高于非高黏液型菌株(P<0.05),高黏液型菌株在泌尿系统感染患者的检出构成比却低于非高黏液型菌株(P<0.05)。推测其原因可能是肺炎克雷伯菌呼吸道感染多为社区获得性,常为野生型菌株,表现为高黏液型,而肺炎克雷伯菌泌尿系统感染常为医院获得性,多为变异株,表现为荚膜缺失的非高黏液型[10]。就科室分布而言,高黏液型菌株和非高黏液型菌株在呼吸内科、ICU、神经外科等病房的检出构成比差异无统计学意义(P>0.05),但以这3个科室的检出构成比最高。本研究的不足之处是样本量较小,高黏液型菌株和非高黏液型菌株在血流和其他部位的感染率以及其他科室分布的真实差异有待进一步研究。

有研究认为,介导肺炎克雷伯菌荚膜合成的基因可在不同菌株间通过水平方式传递,使不具备高毒力特征的菌株也表现出高黏性[10]。rmpA主要调控荚膜的合成,导致高毒力肺炎克雷伯菌呈现高黏液表型以及细菌毒力增加[11]。本研究中rmpA和rmpA2基因在高黏液型肺炎克雷伯菌中的携带率分别为89.86%和84.06%,明显高于非高黏液型组的16.47%和27.06%,结果与部分研究[12-13]相近。这说明虽然rmpA和rmpA2基因在高黏液型肺炎克雷伯菌中广泛表达,但仍有10%以上的非高黏液型菌株携带黏液表型调节基因。magA仅存在于K1血清型中,被认为是高黏液表型的介导因子[14-15]。本研究中magA基因在高黏液型和非高黏液型两种菌株中的携带率比较,差异无统计学意义(P>0.05),这说明magA基因与肺炎克雷伯菌高黏液型特征之间并无直接关系,这可能与本研究中的菌株来源主要以呼吸道和泌尿系统感染患者为主有关,其血清型与主要来源于化脓性肝脓肿的携带magA基因的K1型菌株之间有很大差异[10]。与经典肺炎克雷伯菌相比,气杆菌素可以使高毒力肺炎克雷伯菌中的铁载体增加,是增强肺炎克雷伯菌毒力的重要因子[16]。在本研究中,aerobactin在高黏液型菌株中的表达明显高于非高黏液型菌株,说明高黏液型肺炎克雷伯菌的毒力总体上强于非高黏液型,但是仍有25%左右的高黏液型菌株和20%左右的非高黏菌株并非如此。

总之,高黏液型与非高黏液型肺炎克雷伯菌感染患者的主要差异在于体温升高以及中性粒细胞百分比升高,且高黏液型菌株毒力基因rmpA、rmpA2及aerobactin的携带率明显高于非高黏液型菌株。但本研究纳入样本量较少,且可供实验室检测的肺炎克雷伯菌毒力基因、炎症指标及临床指征还有很多,高黏液型与非高黏液型肺炎克雷伯菌在毒力和临床特点之间的差异还可进一步研究。