鼻咽癌组织中Wilms瘤相关蛋白及长链非编码RNA DIAPH1-AS1的表达及临床意义*

王 霞,王广元,张一剑

山东省兖矿新里程总医院耳鼻喉科,山东济宁 273500

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽部黏膜的恶性肿瘤。我国每年NPC新发病例达4.46万例,死亡病例达2.42万例[1]。目前放射治疗是NPC的主要治疗方式,特别是适形调强放射技术的临床应用取得了良好效果[2]。但肿瘤局部复发及远处转移仍然是晚期NPC患者治疗失败的主要原因,5年生存率仅为40%,危及患者生命健康[3]。深入研究NPC肿瘤标志物,对于临床早期诊治和预后判断具有重要意义。Wilms瘤相关蛋白(WTAP)编码基因位于6q25.3上,编码蛋白定位于细胞核核质中,在基因的转录和转录后调节中发挥调控作用。近年来发现,WTAP在肝癌、胃癌等恶性肿瘤中表达上调,通过抑制抑癌基因如p21的表达,促进肿瘤细胞G2/M期转换,促进肿瘤的恶性增殖[4-5]。长链非编码RNA(lncRNA)是长度在100～300个核苷酸的RNA分子,广泛参与细胞分化、增殖及凋亡过程的调控[6]。lncRNA DIAPH1-AS1是近年来新发现的lncRNA,体外细胞实验表明,lncRNA DIAPH1-AS1能够促进NPC细胞的增殖及转移,可能是新的NPC肿瘤标志物[7]。因此,本研究通过检测NPC组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的表达,探讨二者的临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年3月至2018年3月本院诊治的78例NPC患者的临床资料。纳入标准:(1)经病理学检查明确诊断为鼻咽部鳞癌并符合2009年欧洲肿瘤内科学会制订的《鼻咽癌临床实践指南》中的诊断标准[8];(2)既往无放化疗及免疫治疗史;(3)患者临床病理和随访资料完整。排除标准:(1)随访过程中发生第二原发癌。(2)合并其他恶性肿瘤。(3)伴心、肺、肝、肾等器官功能不全。78例NPC患者中,男48例,女30例;年龄34～78岁,平均(59.8±6.0)岁;有吸烟史38例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期48例,Ⅲ～Ⅳ期30例;肿瘤分化程度:中高分化45例,低分化33例;淋巴结转移:有41例,无37例。本研究经本院伦理委员会审核批准通过。

1.2仪器与试剂 微量分光光度计Narodrop 2000购自美国赛默飞公司,总RNA提取试剂盒购自北京索莱宝生物有限公司(货号R1200),反转录试剂盒购自北京索莱宝公司(货号T2240),SYBR Green Mix实时荧光定量PCR(qPCR)试剂盒购自南京欧凯生物公司(货号M107R1),WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1及内参GAPDH的引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。

1.3方法

1.3.1检测方法 qPCR检测,取癌及癌旁组织标本,液氮研磨后,3 000 r/min离心5 min,离心半径10 cm,取上清液,利用总RNA提取试剂盒提取组织中总RNA,Narodrop 2000检测RNA浓度及纯度。采用反转录试剂盒将组织中总RNA反转录为cDNA,进行qPCR反应。引物序列,WTAP正向序列:5′-GCAACAACAGCAGGAGTCTGCA-3′,反向序列:5′-CTGCTGGACTTGCTTGAGGTAC-3′。lncRNA DIAPH1-AS1正向序列:5′-ACACTAAAGCTGGGATGGCT-3′,反向序列:5′-TTTCCAGGATGTCAGGCAAC-3′。内参GAPDH正向序列:5′-TGATGACATCAAGAAGGTGG-3′,反向序列:5′-TTGTCATACCAGGAAATGAGC-3′。总反应体系10 μL,其中模板cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL,SYBR Master Mix 5 μL,ddH2O 3 μL。程序:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的相对表达水平以2-ΔΔCt表示。

1.3.2随访 本研究自患者病理诊断明确后开始进行随访,每3个月电话随访1次,随访终点事件为患者因NPC或其并发症死亡,连续随访3年,随访截止时间2021年3月。

2 结 果

2.1NPC组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表达比较 NPC癌组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1相对表达水平分别为2.14±0.35、2.37±0.38,癌旁组织中分别为0.74±0.12、0.80±0.14,NPC癌组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1相对表达水平明显高于癌旁组织,差异有统计学意义(t=34.346、36.193,P<0.05)。

2.2WTAP与lncRNA DIAPH1-AS1表达的相关性 Pearson相关分析结果显示,NPC组织中WTAP与lncRNA DIAPH1-AS1表达呈正相关(r=0.524,P<0.05)。

2.3NPC组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表达与临床病理特征的关系 不同TNM分期、淋巴结转移的NPC患者癌组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表达差异有统计学意义(P<0.05),TNM分期Ⅲ～Ⅳ期,有淋巴结转移的NPC患者癌组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的表达分别明显高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期,无淋巴结转移的NPC患者(P<0.05)。不同性别、年龄、分化程度、吸烟史的NPC患者癌组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 NPC组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表达与临床病理特征的关系

2.4WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1对NPC的诊断价值 绘制WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1及联合检测对NPC诊断的ROC曲线,结果显示,WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1及联合检测对NPC诊断的曲线下面积(95%CI)分别为0.801(0.734～0.863)、0.738(0.651～0.827)、0.896(0.853～0.938),联合检测时曲线下面积明显大于WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1单独检测的曲线下面积(Z=2.392、3.302,P=0.017、0.001)。见表2。

表2 WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1对NPC的诊断价值

2.5NPC患者癌组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表达对预后的影响 对所有NPC患者随访3～36个月,中位随访时间31个月。随访期间无失访,死亡23例,3年总体生存率为70.51%(55/78)。以WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的相对表达水平2.10、2.34为临界值,分为WTAP高表达组39例和WTAP低表达组39例,lncRNA DIAPH1-AS1高表达组40例和lncRNA DIAPH1-AS1低表达组38例。Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明,WTAP高表达组3年总体生存率为51.28%(20/39),明显低于低表达组的89.74%(35/39),差异有统计学意义(χ2=5.834,P<0.05)。lncRNA DIAPH1-AS1高表达组3年总体生存率为55.00%(22/40),明显低于低表达组的86.84%(33/38),差异有统计学意义(χ2=5.041,P=0.005)。见图1。

注:A为lncRNA DIAPH1-AS1表达对NPC患者生存预后的影响;B为WTAP表达对NPC患者生存预后的影响。

2.6单因素及多因素Cox回归分析影响NPC患者生存预后的因素 对影响NPC患者生存预后的因素进行单因素Cox回归分析,将性别(男=0、女=1),年龄(34～60岁=0、>60～78岁=1),吸烟史(无=0、有=1),分化程度(中高分化=0、低分化=1),TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期=0、1=Ⅲ～Ⅳ期=1),淋巴结转移(无=0、有=1),WTAP表达(低表达=0、高表达=1),lncRNA DIAPH1-AS1表达(低表达=0、高表达=1)引入回归方程,结果表明,TNM分期、淋巴结转移、WTAP及lncRNA DIAPH1-AS1表达是NPC患者生存预后的独立影响因素。多因素Cox回归分析结果表明,TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、WTAP高表达、lncRNA DIAPH1-AS1高表达是影响NPC患者生存预后的独立危险因素。见表3、4。

表3 单因素Cox回归分析影响NPC患者生存预后的因素

表4 多因素Cox回归分析影响NPC患者生存预后的因素

3 讨 论

NPC具有较高的侵袭性和早期转移特征,许多NPC患者在首次诊断时已处于晚期,患者远期生存预后仍不理想。深入研究NPC的分子机制,有助于NPC的临床诊治。N6-甲基腺苷(m6A)修饰是近年来新发现的转录后调控机制,参与NPC肿瘤的发生发展[9-10]。

WTAP基因位于人类6号染色体上,编码蛋白作为一种m6A书写器,能够甲基化修饰RNA分子,调控下游基因表达。研究表明,WTAP在肝细胞癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中表达升高,其作为一种致癌基因,发挥促进肿瘤恶性增殖和转移的作用[11]。本研究表明,WTAP在NPC癌组织中的表达较癌旁组织上调。NPC组织中WTAP表达上调的机制可能与WTAP转录后调控异常有关。研究发现,miR-501-3p能够通过靶向结合WTAP mRNA的3′非编码区,改变WTAP mRNA的稳定性,肿瘤发生时miR-501-3p表达异常下调,导致WTAP mRNA的稳定性增加,促进WTAP的表达,致使肿瘤细胞过度增殖[12]。本研究中,肿瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期,有淋巴结转移的NPC患者癌组织中WTAP表达较高,提示WTAP的表达升高可能参与促进NPC的肿瘤的恶性进展。分析其机制可能为,肿瘤中WTAP的表达上调能够招募转录起始因子3复合体激活Wnt信号通路,促进肿瘤细胞发生上皮间质转化,增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[13]。此外,WTAP通过促进m6A修饰微囊蛋白1的表达,微囊蛋白1能够激活核因子-κB信号通路,促进肿瘤细胞的恶性增殖[14]。本研究通过生存分析表明,WTAP高表达的NPC患者生存预后较差,并且WTAP高表达是患者生存预后的独立危险因素,结果表明WTAP是判断NPC预后的潜在生物学标志物,检测WTAP的表达可能有助于患者治疗后的随访监测,值得临床深入研究。

lncRNA DIAPH1-AS1编码基因位于5q31.3染色体上,是一种新的lncRNA,具有促进蛋白质间相互作用,蛋白质磷酸化激活等生物学功能[15]。本研究中,NPC患者癌组织中lncRNA DIAPH1-AS1表达明显升高,其原因可能与lncRNA DIAPH1-AS1受到上游WTAP的m6A修饰调节有关。研究发现,WTAP能够通过胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2依赖性途径m6A修饰lncRNA DIAPH1-AS1的表达,促进NPC肿瘤细胞中的lncRNA DIAPH1-AS1稳定性,导致lncRNA DIAPH1-AS1表达升高[7]。本研究中,lncRNA DIAPH1-AS1表达升高与较高的肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关,提示lncRNA DIAPH1-AS1的表达升高促进NPC的疾病进展。研究表明,lncRNA DIAPH1-AS1作为一种分子支架促进异黏蛋白、LIM和SH3蛋白1复合物的形成,诱导LIM和SH3蛋白的表达,促进NPC肿瘤细胞的过度增殖和转移[7]。本研究发现,lncRNA DIAPH1-AS1高表达的NPC患者的生存预后较差,并且是患者不良预后的独立危险因素,表明检测NPC患者癌组织中lncRNA DIAPH1-AS1表达有助于NPC患者的临床预后预测,是新的预后判断的肿瘤标志物。本研究中,NPC患者WTAP与lncRNA DIAPH1-AS1表达呈正相关。WTAP的高表达能够通过m6A甲基化修饰增加lncRNA DIAPH1-AS1的稳定性,lncRNA DIAPH1-AS1表达升高通过激活下游癌基因表达,促进NPC的肿瘤进展。因此,NPC中WTAP与lncRNA DIAPH1-AS1可能存在协同关系,共同促进NPC的肿瘤进展。此外,本研究中,WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1联合检测对NPC具有较高的诊断价值。临床上,医师可以根据NPC患者癌组织中WTAP 和lncRNA DIAPH1-AS1的表达,进行早期诊断并评估NPC患者的临床预后,对高危患者进行积极治疗及随访,从而改善高危患者的生存预后。

综上所述,NPC患者WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表达升高,二者表达呈正相关。NPC患者WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关,WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1高表达是影响NPC患者生存预后的独立危险因素,是新的NPC预后相关的肿瘤标志物。但本研究也存在一定的局限性,首先,本研究中虽然已经有癌旁组织为对照,但可能与正常组织中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的表达情况仍存在一定的差异,有待今后设置正常对照组做进一步研究。其次,本研究样本量有限,随访时间较短,有待今后扩大样本量深入研究,为临床提供新的治疗靶点。