番茄红素对脑缺血再灌注大鼠海马神经元PTEN-PI3K/Akt信号通路的影响

王 晨,夏 征,王光安,任乐宁

河南推拿职业学院针灸推拿系 河南洛阳 471023

番茄红素(lycopene)是广泛存在于蔬果中的类胡萝卜素,人体无法自行合成,具有强烈的抗氧化、抗肿瘤、抗炎以及抗衰老等多种生理功能[1],能够改善肾脏和肝脏的缺血再灌注(ischemia-reperfusion,IR)损伤[2-3]。PI3K/Akt信号通路存在于多种组织和细胞内,参与细胞生长、凋亡等多种生物学过程的调控[1]。PTEN是一种抑癌基因,可负反馈抑制PI3K/AKT信号通路的传导,参与IR损伤的调控[4]。本研究以线栓法建立大鼠脑IR模型,观察番茄红素对模型大鼠海马组织学表现、细胞凋亡及PTEN及PI3K/AKt信号通路相关蛋白表达的影响,探讨番茄红素对IR脑组织的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料及仪器雄性SD大鼠38只(180～200 g),购自北京维通利华公司 [SCXK(京)2015-0036],SPF级,饲养于恒温23 ℃、昼夜节律光照条件下,自由进食。番茄红素购自美国Sigma公司。TUNEL凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司。PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2、Bax兔抗多克隆抗体购自英国Abcam公司。β-actin鼠抗多克隆抗体及二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。ECL化学发光液购自Millipore公司。蛋白定量试剂盒购自北京普利莱公司。Western blot系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 大鼠脑IR模型的建立方法线栓法建立大鼠脑IR模型,具体操作参考文献[5-6]。结扎颈内动脉2 h后缓慢取出线栓。缝合切口,抗生素预防感染。术后清醒后,采用ZeaLonga 5分制标准对大鼠进行行为学评分[7]:无神经缺损症状为0分;无法完全伸展左侧前肢为1分;行走时向左侧转圈为2分;行走时向左侧倾倒为3分;不能自发行走,痉挛、昏睡、意识丧失[8-9]为4分。1～3分为造模成功,0分和4分及死亡为造模失败。

1.3 实验分组实验分为假手术组、模型组、番茄红素组。最终共36只用于实验,每组12只。假手术组插入线栓但不结扎血管,余2组均建立IR模型。建模成功24 h后,番茄红素组按10 mg/kg灌胃番茄红素(玉米油配置),1次/12 h,连续7 d;假手术组和IR模型组给予等剂量玉米油灌胃,连续7 d。

1.4 大鼠脑组织学观察①TCC染色:治疗结束后,每组取3只大鼠断头取脑,等渗盐水冲洗,-20 ℃冰冻20 min,然后置于模具中,自视交叉水平做等距离连续冠状切片,片厚2 mm。将切片放于37 ℃ TTC溶液中避光孵育30 min,多聚甲醛固定24 h,拍照,利用Image-Pro Plus5.0图像处理软件分析。②HE染色:治疗结束后,每组取3只大鼠,灌注固定,取海马组织,制备低温冰冻切片,常规HE染色,显微镜下观察。

1.5 大鼠海马组织细胞凋亡的检测治疗结束后,每组取3只大鼠,灌注固定取海马组织,制备低温冰冻切片,每只大鼠选取海马CA3区组织切片3张,TUNEL法检测细胞凋亡,按试剂盒说明操作。每张切片选取5个视野(200×),计数棕褐色染色细胞(凋亡细胞)和细胞总数,计算细胞凋亡率。

1.6 大鼠海马组织中PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2和Bax蛋白表达的检测每组取3只大鼠,断头取脑后固定,取海马组织,Western blot法测定目的蛋白表达水平。一抗包括PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2、Bax和β-actin抗体。ECL试剂发光,凝胶成像仪观察成像,用Quaulity One软件分析条带灰度值,以目的蛋白与内参β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白表达水平。

1.7 统计学处理应用SPSS 18.0进行数据处理。3组大鼠各指标的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组大鼠脑梗死面积和海马神经元形态TTC染色结果(图1)显示,模型组大鼠脑梗死面积显著大于假手术组,番茄红素组小于模型组。HE染色结果(图2)显示,假手术组大鼠海马CA3区神经元形态正常,排列致密,结构清晰,未见细胞坏死。模型组细胞稀疏,细胞核大,胞核固缩、深染,间隙增大,坏死神经元明显增多。番茄红素组神经元形态大多正常,坏死神经元较模型组减少。

图1 假手术组(上)、模型组(中)和番茄红素组(下)大鼠脑梗死面积(TTC染色)

图2 假手术组(左)、模型组(中)及番茄红素组(右)大鼠海马组织形态学表现(HE,×400)

2.2 3组大鼠海马组织中细胞凋亡率的比较TUNEL染色结果(图3、表1)显示,模型组细胞凋亡率大于假手术组,番茄红素较模型组降低。

2.3 3组大鼠海马组织中PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2和Bax蛋白表达的比较见表1。与假手术组比较,模型组海马组织中PTEN、Bax表达水平升高,PI3K、Akt、Bcl-2表达水平降低。与模型组比较,番茄红素组PTEN、Bax表达水平降低,PI3K、p-Akt、Bcl-2表达水平增高。

表1 3组大鼠海马组织中细胞凋亡率及PI3K、p-Akt、PTEN、Bcl-2、Bax蛋白表达的比较

3 讨论

番茄红素是广泛存在于自然界植物中的天然色素。番茄红素能够通过减轻氧化应激和激活PI3K/Akt信号通路,减少阿尔茨海默病模型大鼠神经元的凋亡[1],减轻缺血缺氧诱导的间充质干细胞损害[10];降低脐静脉内皮细胞的氧化应激损伤[11],具有强大的抗氧化、抗肿瘤、抗炎等生物活性。本研究结果显示,番茄红素能够减轻IR诱导的大鼠神经元凋亡,减小脑梗死面积,具有神经保护作用。

多项研究结果显示,抑制PTEN继而激活PI3K/Akt信号通路能够改善IR诱导的神经缺损症状[4,8-12];还能够抑制肝脏[13]IR损伤。Bax是促凋亡基因,Bcl-2是抑制凋亡基因,两者广泛分布于线粒体内膜、核膜、细胞内质网。本研究结果显示,与模型组比较,番茄红素组大鼠海马组织中PTEN、PI3K蛋白表达降低,Akt信号通路相关蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低。因此推测,番茄红素可能通过抑制PTEN表达,激活PI3K/Akt信号通路,促进Akt的磷酸化,继而调控Bax、Bcl-2等信号分子的表达,从而抑制IR大鼠海马神经元的凋亡。

综上所述,番茄红素可以抑制IR海马神经元的凋亡,具备一定的神经保护作用,可能具有治疗脑梗死的应用潜力。