Navβ1亚基对KCNQ通道电流特性的调控

姜 鸣，刘思佳，岳 杰，刘 霞，白占涛

（1.延安大学 生命科学学院；2.陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心；3.延安市多肽资源药物工程技术研究中心；4.延安市神经肿瘤免疫与干细胞重点实验室，陕西 延安 716000）

电压门控钾通道（voltage-gated potassium channel，Kv）Kv7 家族也被称为KCNQ 钾通道，是一种介导M电流外向整流的电压门控型钾离子通道，在人体生理过程中起关键作用，包括心脏动作电位，钾稳态和神经元兴奋性等［1-2］。KCNQ通道包含5个α亚基（Kv7.1-Kv7.5），由KCNQ1至KCNQ5基因编码，这些α亚基排列为同源或异源，各自具有特征性组织分布和功能，KCNQ基因突变通常与许多心脏、听觉和神经系统疾病有关［3-6］。选择性激动剂和抑制剂对KCNQ 通道的调节可以改善由KCNQ 通道异常诱发的心律失常、癫痫发作、进行性听力损失和疼痛等相关疾病的诊治。KCNQ 通道不同亚型特异性激活剂和抑制剂的开发与使用有助于理解KCNQ通道参与许多疾病发生的作用机制，寻求更优的诊疗方法［7］。

电压门控钠离子通道β1 亚基（Voltage-gated sodium channels β1 subunit，Navβ1），由SCN1B基因编码，定位于心室细胞的夹层、T管及心房细胞的闰盘，是负责调节电压门控钠离子通道的动力学和表达的辅助亚基［8-9］，也与细胞的迁移、神经突增长以及轴突向导等钠通道α 亚基所缺失的功能有关［10］。研究发现Navβ 亚基在癫痫、神经病、心脏功能性疾病以及癌症中都有一定的作用［11］，Navβ1 亚基虽然以钠离子通道辅助亚基的身份被发现，但其对Kv通道也具有调控作用。前期研究结果发现，当Navβ1亚基与不同Kv 通道共表达时，其可以激活Kv4.3 通道的开放［12-13］，增强Kv4.2 通道的电流密度［14］，通过加强与通道的结合，抑制Kv1.2和Kv1.3通道依赖电压的激活［15］，而有关Navβ1 亚基对KCNQ 通道的调控作用鲜有报道。本研究利用体外全细胞膜片钳技术明确了Navβ1亚基对KCNQ 通道及其亚型的调控作用，为解析KCNQ 通道的结构功能以及KCNQ通道疾病的诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

研究中所使用的培养细胞是HEK 293T 人胚肾上皮细胞系（BNCC353535，北纳生物）；质粒培养菌株为大肠杆菌DH5α（CD201-01，全式金），Navβ1亚基和KCNQ（1、2、3、4）表达质粒由中国科学研究院、昆明动物研究所、上海大学生命科学学院赠予。

1.2 试剂

DMEM 培养基（11995，Solarbio），完全培养基DMEM+胎牛血清（Gibco®by life technlogies TM）；青霉素-链霉素混合液（P7630，Solarbio）；DMEM+FBS；HEK 293T 细胞转染质粒DNA Lip 3 000；Opti-MEM培养基（无血清培养基）；细胞外液：150 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L HEPES（pH7.4），渗透压280～300 mOs，配制好后用0.22 μm 滤头过滤，4 ℃冰箱保存备用。细胞内液：130 mmol/L 天冬氨酸钾、5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L HEPES、5 mmol/L EGTA（pH7.2），渗透压280～300 mOsm，配制好后用0.22 μm滤头过滤，-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养与转染

HEK 293T 细胞培养：HEK 293T 复苏置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱培养，镜检观察细胞状态（密度60%～80%）。

HEK 293T 细胞转染：KCNQ 通道质粒，Navβ1质粒采用了脂质体介导法，通过脂质体和质粒DNA静电作用结合为DNA 脂质体复合体，镶嵌于膜表面，内吞进入细胞，从而在细胞膜表达。

1.3.2 细胞膜片钳电流记录实验

细胞膜电压钳制在-80 mV，以10 mV 的增量从-80 mV 步阶进至+30 mV，持续时间为200 ms，诱导出KCNQ、KCNQ+Navβ1电流。

1.3.3 全细胞电压钳检测

显微镜下将细胞调至视野中央，利用电子显微操作仪将微电极下降到细胞外液液面后给予液接电位补偿，此时观察电极入液电阻，2～8 MΩ 较佳（入液电阻太小或太大的电极弃之）；通过电子显微操作仪控制电极，当电极处于细胞的斜上方时，调整速度慢慢靠近细胞表面，观察到电阻值略微升高时，利用小针管施加负压，待高阻封接（1 GΩ 以上）状态稳定后，给予电容补偿，破膜，记录电流数据：细胞膜电容（Cm）、串联电阻（Rs）、接入电阻（Ra）、时间常数（t）、Hold。

1.4 数据分析

由于细胞的电流大小受细胞状态，细胞大小不同的影响，本文通过记录全细胞电流（I），细胞膜电容（Cm）计算分析电流密度（Id），对实验结果进行统计学分析。电流密度表示单位细胞膜面积的通道电流大小，利用式（1）计算。

数据的统计统计学分析采用Clampfit 10.3、OriginPro 9.0、GraphPad prism 7.0 软件分析，所有分析结果以平均值±标准误差表示，即Mean±SEM。

2 实验结果

2.1 Navβ1亚基对KCNQ1通道电流的调制作用

为了明确Navβ1亚基对KCNQ 通道及其亚型的调制作用，利用全细胞膜片钳记录了HEK 293T 细胞单独转染KCNQ通道和与Navβ1亚基共同转染时细胞电流特性的变化。将细胞钳制在-80 mV，以10 mV的增量步阶增进至+30 mV，诱导出KCNQ1和KCNQ1+Nav β1 电流（图1A）。结果发现单独转染KCNQ1 通道时，随着激活电压增加，KCNQ1 通道的激活电流强度稳步增加（图1C），当与Navβ1亚基共同转染时，KCNQ1通道的激活电流强度增加幅度减缓（图1D）。在激活电压为+30 mV 时KCNQ1 通道单独转染的电流密度达到峰值为63.9±0.3 pA/pF。与Navβ1 亚基共同转染时，KCNQ1 通道的电流密度显著下降，仅为31.5±1.4 pA/pF（图1B）。结果表明，细胞中Navβ1 亚基的表达可以显著抑制KCNQ1 通道的电流密度，说明Navβ1亚基减少了KCNQ1通道的离子流量，抑制了KCNQ1通道的开放。

图1 Navβ1亚基对KCNQ 1通道电流的调制作用

2.2 Navβ1亚基对KCNQ2通道电流的调制作用

在对KCNQ2通道的检测时，发现Navβ1亚基可以抑制KCNQ2 通道的电流。以10 mV 的增量从-80 mV 步阶增加至+30 mV，诱导出KCNQ2 电流特征（图2A）。随着激活电压增加，KCNQ2 通道的激活电流强度稳步增加，但其增加幅度较小（图2C），而当其与Navβ1 亚基共同转染时，随着激活电压的增加电流强度的增幅显著减小（图2D）。在电流密度的检测中发现，单独转染时KCNQ2通道的电流密度在+30 mV 时达到峰值为19.1±2.1 pA/pF。与Navβ1 亚基共同转染时，KCNQ2 通道的电流密度在激活电压为-80 mV 与+10 mV 之间与其单独转染时无差异。当激活电压为+20 mV 时，与Navβ1亚基共同转染的KCNQ2通道电流密度到达峰值，为10.76±1.0 pA/pF，相较KCNQ2 单独转染时有显著下降（图2B）。这一结果表明Navβ1 亚基抑制了KCNQ2通道的电流密度，在激活电压达到+20 mV以上时表现出抑制效果。

图2 Navβ1亚基对KCNQ2通道电流的调制作用

2.3 Navβ1亚基对KCNQ3通道电流的调制作用

利用激活电压以10 mV 的增量从-80 mV 步阶增加至+30 mV 刺激，诱导KCNQ3 电流时发现（图3A），相较于单独转染KCNQ3 通道，Navβ1 亚基可以增强KCNQ3 通道的电流密度，从-40 mV 开始Navβ1 亚基对KCNQ3 通道电流密度的增强作用便具有显著差异，并且从0 mV 开始其电流密度曲线急速上升，在+30 mV 时达到峰值为56.6±3.0 pA/pF（图3B）。单独转染KCNQ3 通道的电流密度峰值仅为22.2±1.5 pA/pF。在电流轨迹图中也发现，单独转染KCNQ3 通道的电流强度总体较低，仅+10 mV以上高电压激活时的电流强度有明显上升（图3C）。Navβ1 亚基和KCNQ3 共转时电流强度增幅更显著，从-20 mV 开始就有显著增强（图3D）。以上结果表明Navβ1亚基可以增加通过KCNQ3通道的离子流，激活KCNQ3通道。

图3 Navβ1亚基对KCNQ3通道电流的调制作用

2.4 Navβ1亚基对KCNQ4通道电流的调制作用

Navβ1 亚基也可以增强KCNQ4 通道的电流。激活电压以10 mV的增量从-80 mV步阶增进至+30 mV 的诱导过程中（图4A），电流轨迹图中Navβ1亚基共转染对KCNQ4 通道的电流强度并未有显著的影响（图4C 和D）。电流密度统计分析的结果显示，当激活电压为0 mV 以上时，Navβ1 亚基可以显著增强KCNQ4 通道的电流密度。在+30 mV 时，相较于单独转染KCNQ4 通道的电流密度峰值14.2±0.6 pA/pF，与Navβ1亚基共转染KCNQ4通道电流密度峰值可显著上升至24.2±2.2 pA/pF（图4B）。这一结果表明对于Navβ1亚基与KCNQ4通道共转时，可以促进KCNQ4 通道的开放，加快通过KCNQ4 通道的离子流速，激活通道。

图4 Navβ1亚基对KCNQ4通道电流的调制作用

2.5 Navβ1 亚基对KCNQ 通道不同亚型电流的调制差异

Navβ1 亚基对KCNQ 通道不同亚型电流密度峰值作用的统计分析结果显示，Navβ1 亚基可以显著抑制KCNQ1通道的电流密度峰值，其下调幅度可达50.71%，对KCNQ2 电流密度峰值的抑制幅度为43.70%。Navβ1 亚基可以增强KCNQ3 和KCNQ4 的电流密度峰值，其增强幅度分别为154.64% 和70.56%（图5）。结果说明，Navβ1 亚基可以抑制KCNQ1 和KCNQ2 通道的电流，激活KCNQ3 和KCNQ4的电流，对KCNQ3的激活效果优于KCNQ4。

图5 Navβ1亚基作用对KCNQ通道亚型电流密度峰值的影响

3 讨论与结论

Navβ1亚基是电压门控钠离子通道的辅助亚基之一，通过与电压门控钠离子通道α 亚基结合调控通道的门控特性与通道的激活和失活［16］。前期研究报道指出Navβ1 亚基作为辅助亚基也可以与钾离子通道结合［14］，并对钾离子通道产生不同的调控作用，Navβ1 亚基在体外可增强异源表达的Kv4.2通道和Kv4.3 通道电流密度［12-13］，易化Kv1.1 和Kv1.2 通道的激活，而抑制Kv1.6通道的活化［14］。本研究利用全细胞膜片钳技术检测发现Navβ1 亚基可以差异性调控异源表达的KCNQ 通道电流特性。实验结果显示，Navβ1 亚基可以抑制KCNQ1 和KCNQ2 通道的活性，而激活KCNQ3 和KCNQ4 通道。同时我们发现，KCNQ2 通道仅在+30 mV 时表现出抑制作用（图2B），而Navβ1 亚基对KCNQ1 通道的抑制作用从-70 mV 开始便具有显著差异（图1B），说明Navβ1 亚基的结合延缓了KCNQ1 通道的激活，相较于KCNQ2通道Navβ1亚基可能更易与KCNQ1 通道发生作用。KCNQ 通道在阈值膜电位下开放，激活阈值接近静息膜电位，对膜兴奋性有强烈的抑制作用［1］，Navβ1 亚基对KCNQ1 和KCNQ2 通道的抑制作用可能与其协同电压门控钠离子通道电流参与细胞兴奋性有关。Nguyen 等报道Navβ1 亚基通过胞外“Ig”结构域与Kv1.3 通道α亚基结合抑制Kv1.3 通道的开放［14］，本研究中发现Navβ1 亚基对KCNQ1 和KCNQ2 通道的抑制效果与Kv1.3 相似，提示Navβ1 亚基可能也是通过其胞外“Ig”结构域与KCNQ1 和KCNQ2 通道结合产生抑制作用，而Navβ1 亚基对KCNQ1 和KCNQ2 通道抑制效果的差异可能与KCNQ不同亚型和Navβ1亚基之间的结合差异有关，其具体机制有待进一步研究。

本研究发现Navβ1 亚基可以易化KCNQ3 和KCNQ4 通道的激活，但作用也具有差异性。Navβ1亚基对KCNQ3 通道的激活效果更加地显著，在-40 mV 的激活电压下就有明显的激活效应（图3B），而对KCNQ4 通道仅在0 mV 时具有显著的激活作用（图4B）。Navβ1 亚基对KCNQ3 通道电流密度峰值的激活程度约为KCNQ4 通道的2 倍（图5），该激活作用提示我们，Navβ1 亚基对KCNQ3和KCNQ4 通道的激活可能与防止癫痫相关神经元和心肌细胞等的过度兴奋及复极化有关。本研究首次发现了Navβ1亚基对KCNQ 通道具有亚型选择性的调控作用，其对KCNQ1 和KCNQ2 通道具有抑制作用，并且对KCNQ1 通道的抑制效果要强于KCNQ2通道。Navβ1亚基对KCNQ3和KCNQ4通道具有激活作用，且对KCNQ3 的激活作用要强于KCNQ4 通道。Navβ1 亚基的这种差异性调控功能，将为解析癫痫及心脏功能障碍等相关疾病中KCNQ通道功能异常调控以及KCNQ通道疾病的诊疗提供新思路。