茉莉酸甲酯调控荻草谷网蚜与小麦互作关系的研究

闫 夏，尚焕章，胡佳振，罗继芬，邵雅婷，郭 娇，徐世才*，罗 坤*

（1.延安大学 生命科学学院；2.陕西省红枣重点实验室，陕西 延安 716000）

荻草谷网蚜（Sitobion miscanthi），属半翅目蚜科，在中国曾被误定名为麦长管蚜（Sitobion avenaeFabricius），是麦田病虫害的优势害虫，对麦类作物的安全生产以及粮食安全带来严峻挑战。因其具有典型的R-对策害虫的特点，这使得化学农药防治成为调控荻草谷网蚜的种群数量的主要手段［1］，为降低化学农药的乱施滥用，也曾出现一些利用生态调控［2-3］、物理防治［4-5］、抗性遗传育种［6-7］等相关方式方法调控麦蚜的种群数量，然而它们的防治效果均不能满足生产的需要［8］。小麦在长期遭受麦蚜取食时，也在协同进化的作用下进化出了自身的防御体系，因此，应用植物自身所具有的植物激素介导的防御通路是发展可持续性防控病虫害的新理念和新策略的重要路径。

在众多植物激素中以茉莉酸类化合物（Jasmonates，JAs）和水杨酸（Salicylic acid，SA）作为信号分子诱导的JA防御通路以及SA防御通路在植物的抗虫性中发挥着重要作用［9-11］。据笔者前期的研究结果表明：麦蚜取食之后可诱导小麦显著提高SA 与JAs 合成关键基因的转录水平，进而引起植物组织累积大量植物防御激素，同时JAs 被证实会抑制SA 防御通路。而茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）属于JAs的一种，外源施加后会引起JAs的大量积累，因此在MeJA 喷施小麦后极有可能通过JAs的积累打破宿主体内的活性氧类化合物（Reactive oxygen species，ROS）的动态平衡，对害虫的取食、生理活动及寄主选择产生影响［12-13］。此外，植物激素介导的植物防御反应可显著减缓宿主的营养生长［14］，而抗氧化酶系在“权衡”植物的生长与防御之间也发挥重要作用，同时害虫为建立长期的寄生关系，害虫也可以通过提高抗氧化酶的活性［15］，以清除体内累积的ROS，进而降低膜质的过氧化程度。同时，生物体内丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的变化常常作为细胞膜质过氧化程度的衡量指标，而植物与昆虫内保护酶活性的高低恰恰能反映出其清除自由基的能力，以及其受到攻击的程度［16］。对于外源施加MeJA 引起JAs 的积累从而对小麦以及荻草谷网蚜抗氧化防御酶活性的相关研究较为缺乏。

本研究通过对小麦外源喷施MeJA［17］，在不同的处理时间点测定小麦体内以及取食该小麦的荻草谷网蚜体内保护酶系，包括过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）等酶活性变化以及MDA 的含量变化，以明确JAs 的积累对麦蚜的取食、生理活动的间接影响，为探究外源施加MeJA的绿色防治荻草谷网蚜提供理论依据与数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

植物材料：供试小麦品种为西农979，将小麦种子单盆单株种植于直径10 cm，高8.5 cm 的花盆中，（花盆中基质与土壤体积比1∶1），小麦用防虫网保护，在条件为23 ℃±3 ℃，L：D=14∶10，相对湿度50%±5%的人工智能温室中生长，统一水肥。待14 d 后到达三叶期时用于试验。

供试虫源：采自陕西省杨凌区，无翅型单克隆系荻草谷网蚜，经延安大学动物生态学实验室多代饲养驯化。

供试试剂：MeJA（纯度为95%）、吐温20（纯度为95%）、冰乙酸（纯度为99.5%）均购自上海麦克林生化科技有限公司，生理盐水购自唐派医疗有限公司。

酶活测定试剂盒：蛋白定量（TP）测定试剂盒、CAT、POD、SOD、MDA酶活测定试剂盒，以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 试验方法

小麦组织酶活测定：选取长势一致的三叶期西农979 小麦喷施浓度为2.50 mmol/L 的MeJA，对照组喷施蒸馏水。并在处理后6、12、24 h 等3 个时间点剪取叶片，称量后按照质量体积比为1∶9，加入0.9%的生理盐水，利用预冷12 h的研钵研磨成匀浆后，4 000 r/min 离心15 min，吸取上清后获得10%组织匀浆上清，放置-80 ℃超低温冰箱保存用于后续植物酶活测定。小麦组织各酶活的测定参考对应酶活试剂盒的使用说明书，并对反应时长略作调整。

荻草谷网蚜酶活测定：选取长势一致的三叶期西农979 喷施浓度为2.50 mmol/L 的MeJA，对照组喷施蒸馏水。并在喷施后12 h接种已饥饿处理12 h的荻草谷网蚜成虫（无翅型），每株小麦接种50头成虫，并于接种6、12、24 h等3个时间点收集小麦叶片上取食的蚜虫，液氮速冻之后保存至-80 ℃超低温冰箱中用以后续酶活的测定。荻草谷网蚜10%组织均浆上清的制备及酶活测定参考对应试剂盒。

1.3 供试器材

2X-600低速离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；DZ-98-ⅡA 电热恒温水浴锅（上海科恒实业发展有限公司）；TU-100 恒温金属水浴锅（上海一恒科技有限公司）；721N EPoch 微孔板分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；UV-3200 紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）。

1.4 数据分析

使用SPSS 26.0 软件对小麦组织以及荻草谷网蚜抗氧化酶等酶活数据进行分析，利用独立性T 检验进行差异性分析（P＜ 0.05）。

2 结果与分析

2.1 对小麦以及荻草谷网蚜SOD活性的影响

由图1可知，在外源MeJA 喷施后小麦叶片组织中SOD活性在前12 h显著低于对照组（CK）（P＜0.05），但在24 h 后与对照组恢复至同一水平。MeJA 处理后的小麦的SOD 水平在实验的24 h 内并没有明显起伏，但未处理的对照组SOD 水平呈现下降趋势。在试验开始6 h 后，对照组小麦SOD 酶活性较处理组高12.07 U/mg，而12 h 后对照组SOD 活性开始下降，直至24 h 对照组与处理组SOD 活性下降至同一水平，期间喷施MeJA 后的小麦SOD 活性始终保持在18 U/mg左右。

图1 喷施MeJA对小麦及荻草谷网蚜SOD活性的影响

在荻草谷网蚜取食喷施MeJA 的小麦后对荻草谷网蚜体内SOD活性有显著影响（P＜0.05）。在取食处理后小麦6 h 后荻草谷网蚜体内SOD 活性开始上升，较取食未处理小麦的荻草谷网蚜高出9.31 U/mg；但在24 h 后对照组荻草谷网蚜体内SOD 活性持续升高至36.18 U/mg，处理组荻草谷网蚜体内SOD 活性开始下降，并在24 h 时处理组荻草谷网蚜的SOD活性开始低于对照组荻草谷网蚜（图1）。

2.2 对小麦以及荻草谷网蚜POD活性的影响

与SOD 活性变化趋势不同，小麦对照组以及MeJA 处理组的POD 活性整体呈现先上升后下降的趋势（图2）。在前12 h 对照组与MeJA 处理组的POD 活性没有显著差异（P＞0.05），但在24 h 后MeJA 处理组的POD 活性开始显著低于对照组（P＜0.05）。在整个实验过程中，MeJA处理组的POD活性始终低于对照组。

图2 喷施MeJA对小麦以及荻草谷网蚜POD活性的影响

荻草谷网蚜取食喷施MeJA 的小麦后POD 活性与对照组相比没有显著变化（P＞0.05）。虽然，处理组荻草谷网蚜POD 活性没有显著变化，但研究中发现取食未被喷施MeJA 小麦的荻草谷网蚜的POD 活性，随着时间的延长，活性较为稳定；但取食处理组小麦的荻草谷网蚜在12 h 时POD 活性从6 h 时的3.21 U/mg 上升至4.21 U/mg，并且在12 h 后处理组荻草谷网蚜的POD 活性开始高于对照组荻草谷网蚜（图2）。

2.3 对小麦以及荻草谷网蚜CAT活性的影响

与对照组相比，外源施加MeJA 对小麦叶片的CAT活性均无显著差异。然而，在整个实验过程中，随着时间的推移无论对照组小麦还是MeJA 处理组的小麦叶片中CAT活性均呈现下降趋势（图3）。

图3 喷施MeJA对小麦以及荻草谷网蚜CAT活性的影响

由图3 可知取食处理后小麦的荻草谷网蚜的CAT 活性在24 h 时显著高于对照组荻草谷网蚜（P＜0.05），但在前期时外源MeJA 对荻草谷网蚜的CAT活性的影响并不显著（P＞0.05）。24 h时对照组荻草谷网蚜CAT 活性下降，同时处理组的CAT 活性开始上升并显著高于对照组荻草谷网蚜的CAT 活性。总体来说，取食喷施MeJA 小麦的荻草谷网蚜的CAT 活性的变化趋势与对照组相反，对照组的CAT活性随着时间推移先上升后下降，而处理组的CAT活性力先处于了一个较高的水平后开始下降但一段时间后又有上升趋势。

2.4 对小麦以及荻草谷网蚜MDA含量的影响

MeJA 处理后的小麦叶片内的MDA 含量并没有显著影响（P＞0.05）。在喷施MeJA 后的6 h 以及12 h 时，处理后的小麦中MDA 含量都略高于对照组，但并没有显著差异，并且小麦叶片中MDA 的含量水平并没有随着时间的推移产生明显的变化（图4）。

图4 喷施MeJA对小麦以及荻草谷网蚜MDA含量的影响

取食喷施MeJA 处理小麦的荻草谷网蚜的MDA含量与对照组荻草谷网蚜相比没有显著差异（P ＞0.05）。但是，在处理组荻草谷网蚜取食24 h 后开始有升高趋势，从6 h 和12 h 时的0.60 nmol/mg 左右的含量水平上升至0.91 nmol/mg，反观对照组的MDA 含量随时间变化并没有明显起伏，始终在0.60 nmol/mg左右（图4）。

3 讨论和结论

通常，生物体内活性氧的产生和清除处于动态平衡中，而当植物或者昆虫受到胁迫时，其体内MDA 的含量会大幅度上升，而MDA 含量的高低也代表了其体内细胞膜受到的攻击程度，因此MDA的含量与保护酶活性高低紧密相关；保护酶系中的SOD 主要作用为清除超氧阴离子自由基（O2-），这个过程会产生过氧化氢（H2O2），后续通过POD 或者CAT进一步分解或利用［18］。

本研究结果表明在外源MeJA 的作用下，无论是直接作用的小麦还是取食处理后小麦的荻草谷网蚜其细胞膜均未受到明显攻击。但取食后的荻草谷网蚜SOD以及 CAT活性均有所升高，表明荻草谷网蚜在取食处理后的小麦后体内O2-升高，使得其受到一定程度的损伤，因此可以看到在24 h 时荻草谷网蚜体内MDA 含量是有一定的升高趋势的。而对于小麦来说，外源MeJA 的喷施使得其SOD、POD的酶活在一定程度上下降，说明外源MeJA 喷施降低了小麦体内O2-的含量，使其不易受到伤害。但有研究表明POD 能将酚类物质氧化为醌及其聚合物，可以抑制昆虫取食［19］，因此MeJA 的喷施可能降低了小麦的抗虫性。

在之前的研究中发现，喷施MeJA 会使得小麦内JA 合成相关基因上调，而JA 的合成会促进植物生成色胺（Tryptamine，TAM）［20-21］，而TAM 转化的产物包括5-羟色胺（serotonin）和生长素（Auxin），其中5-羟色胺证实会提高植食性昆虫的适应性［21-22］，而生长素的主要作用是促进植物体的生长，在一定程度上会改善蚜虫的取食环境，但同时蚜虫取食又会使得SA 防御通路激活，使得防御相关病程相关蛋白基因（Pathogenesis-related protein genes1，PR-1）表达量上调［23］。相反，MeJA 喷施会使得SA 的合成关键基因苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL），以及病程相关基因1的非表达子（Nonexpressor of pathogenesis-related gene 1，NPR1）的表达量显著下降，但会使得色氨酸脱羧酶（Tryptophan decarboxylase，TDC）的表达量显著上升，这些变化极有可能进一步降低小麦体内的ROS 水平，使得抗氧化酶系的活性未呈现显著变化（未发表数据）。

综上所述，由于MeJA 的喷施引起的JAs的积累对小麦抗蚜性的影响是多方面的，且相互之间会有影响。因此外源MeJA 的喷施引起的JAs 的积累虽然会对荻草谷网蚜产生不利影响，但会因后续小麦内自身防御系统的拮抗作用，而被抵消。因此，对于植物激素诱导的小麦抗蚜性的研究需更深层次的研究。