小鼠视神经损伤后神经节细胞和轴突数量的动态变化

沈冰燕，王敏，方叶楠，代琴，谢琪琦，吴文灿

1.温州医科大学 眼视光学院（生物医学工程学院），浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属眼视光医院，浙江 温州 325027

外伤性视神经病变（traumaticoptic neuropathy, TON）又称视神经损伤，主要是因颅脑及额面部遭受外力撞击后直接或间接导致的视神经损伤，是一种重要的致盲性眼病，在头面颅脑复合伤患者中的发病率为0.5%～5%[1-2]。因其损伤靶点明确、病程进展快等特点常作为视神经损伤研究的理想病种，目前尚无有效的治疗方法[3]。既往研究[4-6]表明视神经损伤后轴突再生修复困难，视神经损伤导致轴突断裂会引起视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells, RGCs）的凋亡[7-8]，且RGCs的损伤及丢失存在一定的时间累积效应，因此对于视神经损伤后不同时间点RGCs和轴突丢失情况的评估有利于治疗时间的选择。在本研究中，通过构建小鼠视神经钳夹损伤（optic nerve crush,ONC）模型，探究视神经损伤后不同时间的RGCs和轴突数量的动态变化，了解视神经损伤的病理过程，从而进一步寻找视神经损伤后治疗干预的适宜时机。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：20只SPF级健康C57BL/6J小鼠，1月龄，体质量12～15 g，由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（浙）2018-0017。

1.1.2 药品与主要试剂：盐酸塞拉嗪注射液 （2 mL/支）购自长春华牧动物保健品有限公司；舒泰®20购自法国维克公司；复方托吡卡胺滴眼液购自邯郸康业制药有限公司；盐酸丙美卡因滴眼液购自德国爱尔康公司；氧氟沙星眼膏购自沈阳兴齐制药有限公司；4%多聚甲醛购自北京兰杰柯科技有限公司；曲拉通X-100（Triton-X100）购自北京索莱宝科技有限公司；山羊血清购自北京中杉金桥生物技术有限公司；封闭液配置：Triton-X1000.05 mL， 山羊血清0.5 mL，加9.5 mL 0.01 mol/L PBS；RBPMs抗体、山羊抗兔IgG抗体购自英国Abcam公司；2.5%戊二醛电镜专用固定液购自福州飞净生物科技有限公司；对苯二胺（PPD）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、丙酮与异丙醇购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器：显微手术器械购自上海金钟金属制品厂；反向镊购自瑞士Dumont公司；眼科手术显微镜购自德国徕卡公司；3D玻片扫描仪购自匈牙利3D HISTECH公司；活细胞转盘共聚焦显微镜购自德国蔡司公司；小动物视网膜显微成像系统购自上海辅光精密仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组：1月龄C57BL/6J小鼠20只，随机分为4组：一组为正常对照组，其余三组均为视神经损伤组，分别为左眼视神经损伤后3 d组、损伤后7 d组、损伤后14 d组，每组5只。

1.2.2 小鼠ONC模型的构建：损伤组所有小鼠经舒泰（175 mg/kg）及盐酸塞拉嗪注射液（50 mg/kg）肌肉注射麻醉成功后，右侧卧位置于手术显微镜的操作台上。左眼为手术眼，10%碘伏常规消毒眼表与结膜囊，滴入盐酸丙美卡因滴眼液行结膜角膜表面麻醉，铺无菌洞巾，在颞侧角巩膜缘后约1.5 mm处用眼科剪剪开球结膜及下方筋膜组织，向后钝性分离筋膜及肌肉，充分暴露后方的白色视神经。由同一位手术操作者使用反向镊于球后1 mm钳夹视神经10 s，眼表以及结膜囊内涂氧氟沙星眼膏，注意造模过程中避免损伤血管。手术操作后的动物一般状况良好，眼部无感染，眼底照相以及视网膜光学相干断层（optical coherence tomography, OCT）成像见视网膜正常或有轻微水肿表现，无白内障，无眼底出血者可视为造模成功，纳入后续实验。

1.2.3 视网膜全层与神经节细胞复合体（ganglion cell complex, GCC）层厚度测量：对正常对照组以及损伤后3、7、14 d的小鼠进行麻醉，双眼滴入复方托吡卡胺滴眼液散瞳后，采用小动物显微成像系统进行双眼眼底照相以及损伤眼的OCT成像，OCT图像以视乳头为中心，分别进行水平扫描和环形扫描。利用insight软件对OCT图像进行半自动分层，分划出GCC以及视网膜全层，利用软件直接导出厚度数据。

1.2.4 小鼠视神经及视网膜取材：对正常对照组以及损伤后3、7、14 d的小鼠进行深度麻醉，颈椎脱臼法处死，切断头颈部，将头放置在冰上，完全暴露白色视神经及视交叉，用眼科剪从视交叉前脚处离断视神经，分别取出小鼠双侧眼球和左侧视神经。

1.2.5 视网膜铺片与组织免疫荧光染色：眼球利用1 mL针头于角巩膜缘穿孔，浸入4%多聚甲醛中固定12 h，用眼科剪沿着角巩膜缘剪去角膜，去除晶状体和玻璃体后，置入4%多聚甲醛中固定1 h，视网膜经5%山羊血清封闭液封闭12 h后，浸入以0.01 mol/L PBS按1:400稀释的RBPMs抗体，4 ℃冰箱孵育过夜。洗涤后加入1:400稀释的山羊抗兔二抗，避光室温孵育2 h，洗涤后将视网膜平均剪成四瓣，并展平置于载玻片上，自然干燥后封片，活细胞转盘共聚焦显微镜下观察RGCs的分布与数量。以视乳头为中 心，将视网膜从内至外区域分划三等分（红色虚线圈）。在“四叶草”状的视网膜上，每一瓣上的每一区域选定1 mm2面积区域（正方形）拍摄并计数RGCs数量。同一种颜色的正方形代表其所处于同一区域（见图1），使用ImageJ软件计数视网膜不同区域的RGCs数量。

图1 小鼠视网膜铺片区域分划模式图

1.2.6 轴突电镜与PPD染色：取正常对照组及损伤组小鼠钳夹损伤后3、7、14 d损伤灶部位的视神经，取材步骤同1.2.4，分别切成1.0 mm3大小的组织块，4 ℃、2.5%戊二醛固定过夜，经0.01 mol/L PBS洗涤后，1%锇酸避光室温固定2 h，丙酮梯度脱水后，环氧树脂包埋剂渗透包埋，制作视神经横截面的超薄切片，每个组织连续切3～7片，PPD试剂利用等体积比的甲醇和异丙醇进行溶解，1% PPD溶液染色35 min，甲醇和异丙醇等体积混合溶液冲洗3 次，干燥后封片，用3D玻片扫描仪捕获视神经横截面图像，每张切片选取5个独立区域（见图2A），使用ImageJ软件进行分析，以获得每个区域存活的轴突数和死亡的轴突数（见图2B）。轴突存活率=存活的轴突数/（存活的轴突数+死亡的轴突数）×100%，5个区域的平均轴突存活率作为每张切片的轴突存活率，同一小鼠所有切片轴突存活率的平均值作为其轴突存活率。

图2 小鼠视神经轴突计数示意图

1.3 统计学处理方法采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验；GCC层厚度、RGCs数量及轴突存活率数据三者均符合正态分布，采用Pearson相关进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ONC后的活体观察小鼠正常眼的视网膜呈淡红色，视盘呈黄色，视网膜血管呈放射状走行（见图3A、图3E-H）。ONC不同损伤时间点的眼底情况均未发现眼底出血或缺血情况（见图3B-D）。

图3 小鼠视神经损伤后不同时间点的眼底照相

2.2 小鼠视神经损伤后不同时间点视网膜与GCC层厚度变化根据小鼠视神经损伤后不同时间点损伤眼的OCT成像，测量并分析视神经损伤后不同时间点的视网膜与GCC层厚度变化（见图4）。研究发现小鼠视神经损伤后3 d组的GCC层厚度与正常对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；视神经损伤后7 d组和14 d组的GCC层厚度较正常对照组和损伤后3 d组显著变薄（P＜0.05）；小鼠正常对照组及视神经损伤后3 d组、损伤后7 d组、损伤后 14 d组，各组间的视网膜全层厚度差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 小鼠视神经损伤后不同时间点GCC层和视网膜全层厚度比较（每组n=5，±s，μm）

表1 小鼠视神经损伤后不同时间点GCC层和视网膜全层厚度比较（每组n=5，±s，μm）

与正常对照组比：aP＜0.05；与损伤后3 d组比：bP＜0.05；与损伤后7 d组比：cP＜0.05

组别GCC层厚度视网膜全层厚度水平扫描环形扫描水平扫描环形扫描正常对照组69.86±5.0371.75±2.37203.89±39.65249.60± 5.10损伤后3 d组69.02±1.8471.43±4.52216.43±33.19220.96±37.86损伤后7 d组60.92±3.28ab62.98±2.81ab235.68±11.75247.25± 9.39损伤后14 d组54.44±1.77abc55.66±1.88abc232.85± 6.09236.93± 5.31

图4 小鼠视神经损伤后不同时间点的视网膜OCT成像

2.3 小鼠视神经损伤后不同时间点RGCs的丢失

RBPMs阳性细胞代表视网膜RGCs（见图5）。与正常对照组相比，损伤后3 d组视网膜不同区域的RGCs数量，差异均无统计学意义（P＞0.05）；与正常对照组比较，视网膜近视乳头区域的RGCs数量在视神经损伤后7 d显著减少（P＜0.05）；视网膜远视乳头区域的RGCs数量，视神经损伤后7 d组与正常对照组、损伤后3 d组相比显著减少（P＜0.05）；损伤后14 d组视网膜不同区域的RGCs数量与正常对照组、损伤后3 d组、损伤后7 d组相比均显著减少（P＜0.05），见表2。

表2 视神经损伤后不同时间点视网膜RGCs数量比较（每组n=5，±s）

表2 视神经损伤后不同时间点视网膜RGCs数量比较（每组n=5，±s）

与正常对照组比：aP＜0.05；与损伤后3 d组比：bP＜0.05；与损伤后7 d组比：cP＜0.05

组别近视乳头区域中间区域远视乳头区域正常对照组239.60± 23.89235.60±46.95208.40±41.94损伤后3 d组285.20±110.17272.60±98.62223.00±73.95损伤后7 d组122.40± 33.10a128.80±27.95100.20±11.50ab损伤后14 d组44.40± 4.04abc44.40± 4.39abc38.40± 2.97abc

图5 小鼠视神经损伤后不同时间点及不同区域的视网膜RGCs的RBPMs免疫荧光染色图（标尺为50 μm）

2.4 小鼠视神经损伤后不同时间点轴突存活率与正常对照组相比，损伤后不同时间点的轴突存活率均显著降低（P＜0.01）；且视神经损伤时间越长，轴突存活率越低，各不同损伤时间组间轴突存活率差异均有统计学意义（P＜0.05），见图6。

图6 小鼠视神经损伤后不同时间点的轴突存活率

2.5 小鼠视神经损伤后视网膜GCC层厚度、RGCs数量及轴突存活率之间的相关性分析同一只小鼠相同损伤时间的GCC层厚度（环形扫描和水平扫描）、RGCs数量以及轴突存活率三者之间均呈显著正相关（P＜0.01），见图7。

图7 小鼠视网膜GCC层厚度、RGCs数量以及轴突存活率之间的相关性分析

3 讨论

TON可以分为视神经原发性损伤和视神经继发性损伤，视神经原发性损伤主要包括外伤时瞬间外力造成的改变、出血、视神经撕裂周围结构如骨质对视神经的压迫及视神经震荡等，而视神经继发性损伤的机制较为复杂，主要包括组织水肿、动脉血管的痉挛、循环障碍、炎症反应对轴突的损害、RGCs的继发性死亡等[9]。常用的用于建立视神经损伤的动物模型有小鼠、大鼠、兔和猫等[10-12]。其中，小鼠因价格便宜、易繁殖、视神经损伤容易操作、视网膜易分离且取材后完整性好等优势，已广泛用于视神经动物模型，因此在本研究选用小鼠作为实验对象。

ONC动物模型是利用不同的夹持器械于球后夹持暴露的视神经，并注意避免眼动脉的损伤，该模型在视神经损伤的实验研究上应用较多，与临床上视神经挫伤较为接近，主要用于进行RGCs的存活和轴突再生方面的研究，具有易于操作、视神经鞘膜保持完整、损伤明确、无需开颅且创伤较小、术后动物存活率高等优点，但目前对于夹持力度大小、夹持时间并未形成统一的规范。不同操作者造成的视神经损伤程度难以保持一致，损伤程度难以精确定量，无统一的、可控制的标准[13-14]。本研究构建了小鼠ONC动物模型，由同一位手术操作者利用同一型号的反向镊，在完整暴露视神经后，球后视神经1 mm处完全闭合夹持10 s，保持一致的夹持力度大小与夹持时间等，使得ONC动物模型的致伤程度相对一致。

RGCs的不可逆性损伤以及选择性丢失是视神经损伤后出现的主要病理改变之一，较高的RGCs存活率有利于视神经损伤后轴突的再生修复[15]。RGCs计数也是目前公认的检验视神经功能的重要指标之一，因此在本研究中，通过视网膜铺片结合免疫荧光染色对视神经损伤后不同时间点的视网膜RGCs进行定量分析，评估视网膜RGCs在ONC术后不同时间点的丢失情况。ONC后，RGCs的损伤及丢失存在一定的时间累积效应，RGC的定量分析是视神经损伤后对损伤程度进行量化观察的良好指标。梅增辉等[16]通过观察大鼠ONC后视网膜形态以及RGCs在不同时间点的计数变化，研究发现视神经损伤后视网膜形态结构发生改变，RGCs损伤的严重程度与损伤时间呈一定相关性，损伤3 d内RGCs数量几乎不变，损伤3～7 d内为RGCs快速丢失期，7～14 d内为中速丢失期，14～28 d为慢速平稳减少期。本研究结果与之前文献报道相一致，在损伤3 d内视网膜不同区域的RGCs数目几乎不变，损伤后7 d和14 d，视网膜不同区域的RGCs与正常对照组相比显著减少，说明在小鼠视神经损伤早期阶段（损伤3 d内），视神经轴突损伤对视网膜RGCs胞体数影响作用小，而视神经长时间损伤会导致视网膜RGCs的显著丢失。

视网膜及神经纤维层厚度的变化对于视神经损伤诊疗具有重要意义，研究[17]表明，神经纤维层变薄是视神经损害的敏感指标之一，甚至早于视野损害和视盘损害的发生。RGCs主要存在于视网膜的神经纤维层、神经节细胞层以及内丛状层中，这3层结构统称为GCC层。本研究中，因小动物视网膜成像系统的局限性，无法对神经纤维层单独分层，因此通过对视网膜及GCC层厚度的测量进一步评估视神经损伤程度。研究结果发现，与正常对照组相比，视神经损伤后3 d组的GCC层厚度差异无统计学意义，损伤后7 d、14 d 组的GCC层厚度显著变薄，且与RGCs数目丢失情况一致。但视神经损伤后不同时间点的视网膜全层厚度，各组视网膜厚度差异均无统计学意义。因此，我们认为GCC层的厚度改变可以作为评价视神经损伤的敏感指标之一，而视网膜全层厚度不能作为视神经损伤程度评价的有效指标。

因神经元的细胞体与轴突是一个整体，胞体和轴突之间常进行物质运输和交换，视神经损伤后轴突中断，轴浆双向流动被阻断，则视神经断端近侧和远端及RGCs胞体都会受到影响[18]。且轴突作为ONC的直接对象，因此在本研究中，轴突的存活率也被作为评价视神经损伤程度的一个指标。研究发现，损伤早期视神经轴突存活率高，小鼠视神经损伤后3 d组的轴突存活率约为59.25 %，但随着损伤时间越长轴突存活率越低。本研究结果发现，轴突存活率与GCC层厚度、RGCs数目的动态变化具有一致性，因此我们进一步对符合正态分布的GCC层厚度、RGCs数量与轴突存活率进行了Pearson相关性分析，结果表明GCC层厚度、RGCs数量与轴突存活率两两之间均呈显著正相关。

综上所述，小鼠ONC模型可以作为视神经损伤研究的动物模型，GCC层厚度、RGCs数量以及轴突存活率均可以作为评价视神经损伤程度的敏感指标。在小鼠视神经损伤早期阶段（损伤3 d内），RGCs胞体以及轴突存活率高，因此早期及时干预治疗有望预防视觉功能的进一步损害。而在视神经损伤中晚期（损伤后7 d至14 d），随着损伤时间延长，RGCs胞体及其轴突存活数量逐渐减少，这可能是长时间视神经损伤的患者诊疗效果不佳的原因之一。但本研究仅为动物实验，小鼠外伤性视神经的病理过程与人类自然疾病过程存在一定区别，因此有关视神经损伤患者其不同损伤时间点视神经损伤程度的评估，有待后续进一步研究。