piRNA在肿瘤中的研究进展

陈艳丽　阳志军

【摘要】 PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）是一类长度18～31 nt的非编码RNA。这类RNA可以通过沉默转座子来维持基因组的完整性，并具有调控下游靶基因的转录和全基因组的DNA的甲基化状态的作用。近年来，研究發现piRNA在肿瘤中的异常表达与肿瘤的预后显著相关。piRNA主要通过影响基因组完整性等方式参与包括肿瘤在内的多种疾病的发生和发展过程。本文重点围绕近年来取得的研究进展，对肿瘤相关piRNA分子机制进行深入阐述，旨在为肿瘤精准诊疗提供新思路。

【关键词】 piRNA 非编码RNA 肿瘤

Research Progress of piRNA in Tumor/CHEN Yanli， YANG Zhijun. //Medical Innovation of China， 2023， 20（10）： -183

[Abstract] PIWI-interacting RNA （piRNA） is a non-coding RNA with a length of 18～31 nt. It can maintain the integrity of the genome by silencing transposons and has the function of regulating the transcription of downstream target genes and the methylation state of genome-wide DNA. In recent years， abnormal expression of piRNA in tumors has been found to be significantly correlated with tumor prognosis. piRNAs take part in the development and progression of many diseases， including tumors， by affecting the integrity of the genome. Focusing on the research progress made in recent years， this paper elaborates the molecular mechanism of piRNA related to tumor in depth， aiming to provide new ideas for accurate diagnosis and treatment of tumor.

[Key words] piRNA Non-coding RNA Tumor

First-author's address： The Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Liuzhou 545005， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.10.042

人类全基因组中仅有2%～3%的基因被翻译成蛋白发挥功能，因为绝大多数基因仅进行了转录。转录物的改变通常由癌症基因组中的体细胞变化引起[1]。这些仅仅进行了转录的基因称为非编码RNA，其种类较多，PIWI蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA， piRNA）是其中一种。piRNA长度18～31 nt，数量在非编码RNA中是最多的，有上百万种[2-3]。随着研究的深入，人类发现它主要通过沉默转座子来维持基因组的完整性参与了包括肿瘤等在内多种疾病的发生和发展过程，其他作用机制包括调控基因的甲基化状态、下游靶基因的沉默、翻译后的蛋白进行修饰等。piRNA在癌症中的异常表达，与肿瘤的预后显著相关[4-5]。本文结合近年来取得的研究进展，重点对肿瘤相关piRNA分子机制进行深入阐述，旨在为肿瘤精准诊疗提供新思路。

1 piRNA的发现及产生途径

二十年前发现的piRNA在基因调控、转座子元件抑制和抗病毒防御中发挥关键作用。piRNA的失调已在包括癌症在内的多种人类疾病中被发现，且不同动物的piRNA簇来自不同的基因组位点，产生piRNA前体的机制略有不同[6-7]。如按照来源将其进行分类，可以分成长链非编码RNA来源的、mRNA来源的和转座子来源的piRNA。在这三种来源的piRNA中，目前只有转座子来源的piRNA被研究得比较深入[2]。piRNA前体通常是由包含重复元件的特定基因组位置产生的，并不依赖于Dicer酶而合成。新生的piRNA需要转录后修饰才能成为成熟的piRNA。

piRNA的生物发生有两条主要途径：初级piRNA产生途径及次级piRNA生存途径——“乒乓循环机制”产生途径。piRNA的初级合成依赖于细胞核中的RNA聚合酶Ⅱ，转录来自piRNA基因簇的小核苷酸序列，形成长的单链前体piRNA，然后将其转移到细胞质中。前体piRNA被核酸内切酶Zucchini催化切割成piRNA前体片段整合到PIWI蛋白中，通过3'-5'外切切割至最终长度，然后分别与PIWI蛋白结合，形成piRNA/PIWI蛋白复合物后被转移回到胞核内。被转移到胞浆的前体piRNA与Ago3或Aub蛋白结合形成piRNA/Ago3或piRNA/Aub复合物，piRNA/Ago3复合物可以作为模板生成新的RNA作为形成新的piRNA的底物，由此产生的新的piRNA可以负载Aub蛋白。然后将piRNA/Aub蛋白复合物产生的RNA作为模板，通过类似的工艺作为底物，形成新的piRNA/Ago3复合物。这种以一种piRNA分子的产物为底物合成另一种piRNA分子的相互作用，实现了两个分子的同时扩增，这就是乒乓扩增[8]。

2 piRNA的结构特点和作用机制

2.1 piRNA的结构特点 piRNA在5'端有强烈的尿苷偏好，而3'端具有2'-O-甲基的独特结构，PIWI蛋白能够与它特异性结合[9]。piRNA不具有保守的二级结构及序列结构域，但Balaratnam等[10]通过生物信息学分析认为人的piRNA存在G-quadruplex（GQ）二级结构，并用生物化学及生物物理的方法证实其有形成GQ二级结果的能力。并且利用凝胶电泳实验证实piRNA的GQ二级结构可抑制其与HIWI-PAZ蛋白的结构域结合，进而影响其和下游靶基因的结合。因此认为piRNA-GQ二级结构，可以赋予其新的调控功能[10]。

2.2 piRNA的作用机制 piRNA在不同的物种中，其序列和结构差异很大，从而导致piRNA在各类物种中的功能差异比较大。现有的研究证据表明，piRNA主要有沉默转座子、基因及修饰蛋白等重要的调控功能[2，11]。在果蝇卵巢中，发现piRNA来源于特定piRNA簇，经加工成成熟后，piRNA与Argonaute蛋白家族的PIWI成员组装，形成piRNA诱导的RNA沉默复合物（piRISCs），被转回到细胞核，并通过在目标转座子位点诱导局部异染色质形成而抑制转座子的共转录[12-13]。在动物生殖系及体细胞中，piRNA对下游基因的靶点可以容忍少量碱基不匹配，并具有靶向所有种系mRNA的能力，并遵循类似于microRNA的配对规则，而发挥沉默基因功能[14-16]。Han等[17]在2021年的研究中发现piRNA-30473在弥漫性大B细胞淋巴瘤中通过调节m6A RNA甲基化而促进肿瘤发生和提示不良预后。在越来越多的肿瘤中发现有piRNA的表达，并参与调控肿瘤细胞的各种生理功能。

2.2.1 影响肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭 piRNA-823在多发性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）组织及细胞系中表达上调，并促进MM细胞的增殖、成管及侵袭能力。其作用机制是促进血管内皮生长因子、白介素-6、细胞间黏附分子-1的表达并抑制细胞凋亡，并促进p16INK4A的异常甲基化，而失去抑癌活性[18]。Li等[19]在非小细胞肺癌中的研究，基于高通量测序手段，使用癌与癌旁组织标本进行测序，发现血清来源的细胞外囊泡piR-hsa-164586作为早期诊断的新生物标志物。并且通过实时荧光定量PCR技术进行再次验证，证实piR-hsa-164586在非小细胞肺癌诊断的曲线下面积达到0.623在全部分期（一期）患者群体中。在结直肠癌（colorectal cancer， CRC）组织中，piRNA-823可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，piRNA-823通过上调热休克因子1的磷酸化和转录活性发挥促肿瘤作用[20]。也有研究发现在直肠癌中piRNA-54265與PIWIL2蛋白结合，形成PIWIL2/STAT3/磷酸化-src复合物，激活STAT3信号通路，促进CRC细胞增殖、转移[21]。在肝脏组织中有66 772个piRNAs表达（已知149个），癌和癌旁组织表达差异明显的有241个piRNAs，转移和非转移肿瘤组织表达差异明显的1 634个piRNAs。差异piRNA的靶基因主要功能富集在细胞黏附上，发现piRNA（piRl/97）促进肝癌细胞的迁移[22]。在乳腺癌中piRNA-36712与SEPW1P（SEPW1的一个反加工伪基因）产生的mRNA相互作用，通过与SEPW1 mRNA竞争microRNA-7和microRNA-324的机制来抑制SEPW1的表达。在乳腺癌中piRNA-36712的下调导致SEPW1表达升高，可能抑制P53，导致Slug表达上调，同时P21和上皮细胞钙粘蛋白表达下降，从而促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移[5]。PiR-39980在骨肉瘤中通过激活基质金属蛋白酶-2来促进迁移和侵袭，并通过对SERPINB1的负调控来抑制细胞死亡[23]。PiR-39980在纤维肉瘤中通过直接靶向其核糖核苷酸还原酶亚基M2的3'非翻译区，从而促进细胞凋亡，抑制纤维肉瘤细胞的增殖[24]。

2.2.2 维持肿瘤细胞的干性 用RT-PCR及软琼脂克隆形成实验鉴定侧群细胞（side population， SP）的干细胞特性，q-PCR法检测SP及非侧群的乳腺癌细胞（non-SP，NSP）中3种PIWI基因（HIWI，HILI和HIWI2）及4种piRNA（piR-4987、piR-20365、piR-20485和piR-20582）的表达水平。结果显示：乳腺癌MCF-7细胞中的SP亚群富含肿瘤干细胞样细胞；HIWI和HIWI2在SP细胞中的水平显著高于NSP细胞（P<0.05）；piR-4987、piR-20365和piR-20582在SP细胞中的表达显著高于NSP细胞（P<0.01）。因此认为乳腺癌干细胞内可能存在类似生殖干细胞内的PIWI-piRNA通路，HIWI、HIWI2、piR-4987、piR-20365、piR-20485和piR-20582可能参与调控乳腺癌干细胞的生物学特性[25]。骨髓来源的抑制细胞通过诱导piRNA-823的表达和DNMT3B的激活赋予多发性骨髓瘤细胞干细胞样的性质。中性粒细胞-髓源性抑制细胞（granulocytic myeloid de-rived suppressor cells， G-MDSCs）促进了MM细胞中肿瘤干细胞（cancer stem cells， CSCs）核心基因的侧群、球的形成和表达[26]。

3 piRNA在肿瘤中的应用现状

随着研究的深入，piRNA在肿瘤领域显示出广阔的应用前景。

3.1 肿瘤诊断 有研究发现在直肠癌患者血清中存在一个5联piRNAs（piR-001311、piR-004153、piR-017723、piR-017724和piR-020365）组合可以作为CRC诊断的血清生物标志物，该组合（piRNA Ⅰ组）临床诊断意义优于癌胚抗原 Ⅱ组，特异性为0.867（P<0.001）[27]。在CRC中，piRNA的失调水平与DNA甲基化和T细胞调节有关。迄今为止，在CRC中仅发现了少数循环的piRNA，然而其表达水平改变是被认为是潜在的候选诊断和预后生物标志物。Vychytilova-Faltejskova等[28]的研究发现血清piRNA-823水平与CRC患者的肿瘤分期呈正相关，在晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者中可观察到明显更高的piRNA-823水平。研究也发现胃液中piR-1245的含量明显高于对照组（P<0.0001）。受试者特征曲线下面积值为0.885[敏感度90.9%，特异度74.2%，95%置信区间（0.828 6，0.941 4）][29]。这些研究发现意味着，piRNAs在肿瘤组织中差异表达，是潜在的肿瘤标志物，具有作为肿瘤诊断的潜力。

3.2 肿瘤治疗 越来越多的研究发现，piRNA是潜在的抗肿瘤治疗的药物靶点。在MM细胞中沉默piRNA-823可以降低G-MDSCs维持的多发性骨髓瘤干细胞的干性，从而降低体内的肿瘤负荷和血管生成。并且G-MDSCs、piRNA-823、DNA甲基化和CSCs核心基因之间的细胞、分子和临床之间存在调控网络。piRNA-823干扰就是在MM微环境中同时针对G-MDSCs和CSCs新的抗癌策略[26]。细胞外囊泡（extracellular vesicles， EVs）可在肿瘤微环境中携带多种RNA，是肿瘤与周围基质细胞（包括内皮细胞）之间通信的关键。piRNA-823在MM患者外周血及MM细胞来源的EVs中积累，MM细胞来源的EVs能有效地将piRNA-823转移至EA.hy926内皮细胞。转染piRNA-823类似物或经MM衍生EVs预处理的EA.hy926细胞促进了异种移植瘤MM的生长。相反，转染piRNA823抑制剂或用转染piRNA-823抑制剂的MM细胞的EVs处理能有效抑制异种移植瘤MM的生长。由此可见，由MM衍生的EVs携带的piRNA-823对于ECs的再生至关重要，通过改变其生物学特性，使其适应MM细胞生长的独特环境。可能为开发piRNA介导的MM的治疗新策略提供依据[30]。piRNA-823在直肠癌中也是潜在的治疗靶点[20]。piRNA piR-Fth1与铁蛋白重链1（Fth1）mRNA中有一个互补序列，在三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer， TNBC）细胞中，pi-Fth1在转录后水平负调控Fth1的表达，piRNA靶标的特定mRNA pi-Fth1可能是TNBC治疗的新靶点[31]。

3.3 肿瘤耐药 有研究发现在直肠癌中piRNA-54265与PIWIL2蛋白结合，形成PIWIL2/STAT3/磷酸化-SRC复合物，激活STAT3信号通路，诱导肿瘤耐药的产生[21]。piRNA-36712可以影响乳腺癌细胞对紫杉醇和阿霉素的敏感性。piRNA-39980在神经母细胞肿瘤中可以通过抑制药物诱导的细胞凋亡，降低神经母细胞肿瘤对阿霉素的敏感性[32]。在三阴性乳腺癌中，Pi-fth1通过HIWI2和HILI靶向Fth1mRNA，引起fth1抑制使TNBC细胞对阿霉素的敏感性显著提高了20倍[31]。这些研究无不显示着，piRNAs在肿瘤耐药中发挥着作用，为逆转肿瘤耐药策略提供新的潛在治疗靶点。

3.4 肿瘤预后 piRNAs在预测肿瘤预后方面也引起了研究者的广泛重视。Ou等[33]的研究发现在衰老中性粒细胞衍生的外体piRNA-17560，它以STAT3依赖性方式通过肥胖相关蛋白介导的m6A去甲基化促进乳腺癌的化疗耐药和上皮间质转化，提示piRNA-17560可作为乳腺癌的潜在治疗靶点并提示患者预后。piRNA-36712在乳腺癌组织中明显低于正常乳腺组织，其低水平表达与患者的临床预后不良相关，这提示piRNA-36712可能是乳腺癌患者预后的潜在预测因子[5]。胃组织的piRNA图谱显示，大多数的piRNA嵌入在蛋白编码序列中（即基因间），并发现一个与无复发生存相关的3联合piRNA序列（FR290353， FR064000和FR387750或者FR157678）[34]。有研究者通过全基因组联合单核苷酸多态性的方法综合分析了3 116个PIWI-piRNA通路基因中常见的单核苷酸多态性位点在黑色素瘤疾病特异性生存中的预后作用，发现PIWI-piRNA通路基因DCP1A的遗传变异可能预测黑色素瘤疾病特异性生存[4]。另有研究发现，piRNA-1245在CRC中高表达，其过表达与晚期和转移显著相关，其高表达的患者总体生存期明显较短，多因素分析发现其可作为CRC的独立预后生物学标志物[35]。piRNA-017724水平较低的直肠癌患者总体生存和无进展生存较差，多因素分析发现血清水平的piRNA-017724是总体生存和无进展生存的独立预后因素[27]。

4 存在问题及展望

针对piRNA的研究已经有10余年，随着高通量测序实验技术及生物信息分析学的发展及推广，使得piRNA的检测及发现得到更为方便简易。RNA结合蛋白免疫沉淀技术的及荧光素酶报告系统等越来越成熟，为进一步研究piRNA的功能提供了坚实的实验技能基础。在某些肿瘤中，piRNA已有了较深入的研究，piRNA在肿瘤细胞中有差异性表达，并与临床分期、转移及预后有关，有望为肿瘤的临床诊断、预后判断及精准的治疗提供靶点。但在肿瘤中piRNA是如何发生调控功能的分子机制尚不明确，piRNA与PIWI蛋白分别单独发生调控作用，还是piRNA与PIWI形成RNA诱导的沉默复合物后共同发挥调控作用？在什么水平发生什么具体的调控功能？因此离系统构建一个完整解释piRNAs和PIWI蛋白的生物发生、功能及其相互作用的知识网络还很遥远。但随着生物实验技术的不断进步及成熟，科学研究者们对piRNA的进一步探索和研究，有待揭开其在肿瘤领域的功能的神秘面纱，进而提高人类对肿瘤的认识。

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（收稿日期：2023-02-07） （本文編辑：张明澜）