小麦耐低磷基因型的鉴定和筛选

魏亚宵，汪军成，姚立蓉，司二静，杨轲，孟亚雄，李葆春，王化俊，尚勋武，马小乐

（1. 甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州 730070；2. 甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070）

磷素是生命体中核酸、蛋白质等有机物的重要组分，且参与了植物诸如光合作用、呼吸作用、能量转化和酶促反应等多种物质和能量代谢，是植物生长发育的必要元素。我国耕地土壤60%以上严重缺磷，为了保证产量只能额外补施磷肥［1］。土壤中的磷酸盐很不稳定，容易被氢氧化物、铁铝氧化物还有钙离子吸附从而形成难溶性化合物［2］，能够被作物吸收和利用的磷素十分有限。磷矿资源具有不可再生性，而我国磷矿资源也并不丰富，农田磷肥主要依赖于进口［3］。如何减缓磷矿的耗竭和减少磷肥施入，筛选和培育耐低磷作物品种具有重要意义，是解决土壤中有效磷匮乏而保持产量相对稳定、保护农业生态环境的重要解决措施之一。

大量研究表明，同一种植物的不同品种对土壤中磷的活化，吸收以及利用会因其遗传背景的不同而具有明显的差异，同类作物在受到低磷胁迫时，不同品种的适应性和磷素的利用效率也存在显著差异［4-6］。研究同一植物不同品种间对磷素耐性的差异，筛选耐低磷和磷高效的品种，减少磷肥的施用量，可以在一定程度上缓解土壤磷资源危机问题。目前关于耐低磷种质资源的筛选与评价主要是在小麦（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryza sativa L.）等作物中已有研究［7-9］。耐低磷品种通常是采用苗期生物学性状、成株期株高、千粒质量等性状进行筛选评价。小麦是最重要的、种植面积最广的粮食作物之一，在我国农业生产中有着举足轻重的地位［10］。孙慧敏［11］等研究表明，在磷素供应充足时，会促进小麦快速发育和植株体内碳氮的正常代谢，保证干物质对磷素的要求，有利于干物质的积累，提早成熟；而在严重缺磷的情况下，小麦次生根仅少量发生或几乎没有。在小麦耐低磷种质的筛选中，通常采用苗期筛选体系，因苗期是小麦生长发育的初期阶段，其磷素的供应情况会对幼苗质量以及生育期壮苗影响较大，因此苗期对逆境胁迫处理相对较敏感，且在苗期筛选成本较低，此阶段是进行小麦耐低磷种质筛选的较好时期。

本试验通过研究不同施磷水平对供试材料苗期生长的影响，测定各小麦品种性状并运用隶属函数法对其进行综合评价分析并排序，为筛选耐低磷小麦品种，为节约磷肥资源以及保护农业生态环境提供了基础和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用9份小麦品种为材料，分别为西旱2号、陇春9786、甘春26号、西旱3号、陇春23号、中麦175、宁春4号、陇春27号、新春17号。所选材料为甘肃省干旱生境作物学重点实验室麦类种质创新课题组在80份材料中进行初步低磷筛选而定的。

1.2 试验设计

每份材料挑选籽粒饱满大小一致的种子，先用5% NaClO溶液消毒5 min，之后用蒸馏水冲洗3次，将种子均匀间隔移入装有蛭石的花盆中，每盆15株，出苗后选取长势一致的幼苗留苗10株，将盆栽置于人工气候室中，温度为22 ℃，湿度为45%，16 h/8 h光照黑暗交替处生长。每天浇定量水，当小麦苗长长到4～5 cm 时，开始浇营养液，配比参照刘露露的方案［12］。 设置正常磷（0.5 mmol/L）和低磷（0.05 mmol/L）2个处理。KH2PO4做为磷源，同时在低磷胁迫的营养液中加入相应浓度的KCl溶液以补充K 元素，其余营养液的成分均相同。将最开始浇营养液的时间记为0 d，每5 d 浇1 次，每个处理3 次重复，处理至第20天时取样测定其苗期性状。

1.3 测定指标

1.3.1 叶绿素含量的测定 参照苏娜的方法用叶绿素仪（ SPAD-502Plus）进行叶绿素含量的测定［13］。

1.3.2 苗长测定 测量从茎基部到顶叶叶尖的长度。

1.3.3 生物量的测定 将样本洗净，置于105 ℃洗烘箱杀青15 min，然后以80 ℃后烘至恒质量，烘干后用电子天平称量，记为干质量。

1.3.4 根系性状的测定 用清水冲洗幼苗的完整根系。采用根系扫描仪（Epson，Long Beach，CA，USA）和WinRHIZO 软件（Quebec，QC，CAN）计算总根长、总根面积和总根体积等根系性状数据［14］。

1.4 数据分析

使用IBM SPSS Statistics 23分析供试材料各性状间的相关性和主成分，并依据隶属函数对供试品种进行聚类分析和综合评价。

式中：μ（Xi）为第i个综合指标的隶属函数值，Xi为第i个综合指标值，Xmax为第i个综合指标的最大值，Xmin为第i个综合指标的最小值。

各综合指标权重的计算：

式中：Wi表示第i个综合指标在所有综合指标中的重要程度及权重；Pi为各品种第i个综合指标的贡献率。

综合评价D值的计算：

式中：D值表示不同小麦品种在KH2PO4的浓度在0.05 mmol/L和0.5 mmol/L时的综合评价值。通过计算加权隶属函数值所得D值。

2 结果与分析

2.1 各性状间耐低磷系数及相关性分析

通过同一指标的低磷测量值与正常磷测量值计算出耐低磷系数可以在一定程度上消除品种间的固有差异，可以较为准确的反映供试小麦品种对低磷环境的耐性。通过分析供试品种苗期各性状的耐低磷系数（表1），结果表明，地上干质量耐低磷系数的范围为0.74～0.97，其中地上干质量耐低磷系数最大的3 个品种依次为新春17 号、西旱2 号和中麦175，值为0.97、0.94和0.93，而地上干质量耐低磷系数较小的为陇春23 号和宁春4 号，为0.74 和0.76。地下干质量耐低磷系数的范围为0.60～1.17，其中地下干质量耐低磷系数较高的品种由大到小依次为西旱2号、新春17 号和中麦18，分别为1.17、1.156 和1.01。而地下干质量耐低磷系数较小的品种为宁春4号和陇春23号，为0.60和0.69。

表1 苗期性状的耐低磷系数Table 1 Low phosphorus tolerance coefficient of seedling traits

通过对各个小麦品种所测定性状的耐低磷系数进行相关性分析（表2），结果表明，地上干质量与地下干质量的耐低磷系数呈极显著正相关关系，相关系数为0.93；叶绿素含量与根体积为极显著正相关关系，相关系数为0.80；苗长与根投影面积的耐低磷系数呈显著性正相关，相关系数为0.72。

表2 苗期性状耐低磷系数的相关性Table 2 Correlation of low phosphorus tolerance coefficient of seedling traits

综上所述，通过对耐低磷系数和对其进行相关性分析后表明，在低磷环境中，不同小麦品种苗期地上部与地下部的生长是呈正相关性关系，根的生长对植株地上部分的生长起着至关重要的作用，小麦不同品种根系部的生长在一定程度上决定了该基因型对低磷环境的适应程度。

2.2 各性状间耐低磷系数的主成分分析

对供试小麦材料苗期各性状的耐低磷系数进行主成分分析（表3），结果显示，前3 个主成分贡献率分别为33.65%，30.46%和22.90%，累计贡献率为87.01%。选择这3个主成分作为小麦苗期各性状耐低磷评价的主要因子。主因子与各个性状之间的相关程度由载荷量的高低来反映（表4），而且一般认为大于0.3 的载荷是显著的［15］。第1 主成分的特征值为2.70，与苗长、根表面积、地上干质量、总根长、根投影面积和地下干质量的相关性最大。第2主成分的特征值为2.44，载荷较高的是叶绿素含量，根体积和根表面积。第3主成分的特征值为1.83，载荷较高的是地上干质量，地下干质量和根体积。通过对耐低磷系数进行主成分分析后表明，根系性状是评价小麦品种对低磷胁迫耐性的重要指标。

表3 特征值和贡献率Table 3 Eigenvalue and contribution rate

表4 苗期性状耐低磷系数的载荷矩阵Table 4 Loading matrix of low phosphorus tolerance coefficient for seedling traits

综上，前3个综合指标的累计贡献率为87.01%，说明前3个综合指标可以代表苗期所测指标的大多数信息，因此将原数据中所测的指标转化为3个综合指标，之后将用这3个综合指标对供试材料进行综合性分析。

2.3 各性状间耐低磷系数的聚类分析和耐低磷种质筛选

根据对耐磷响应系数的主成分分析分别得到3个相互独立的综合指标，计算不同品种各综合指标的隶属函数值μ（Xi）。从表5可以看出，在同一综合指标C1中，新春17号的值最大，为1.946。表明新春17号低磷响应最弱，较耐低磷。根据各综合指标贡献率，计算其权重Wi，计算得到与耐磷性相关的3个综合指标权重分别为 0.39，0.35，0.26。进一步计算综合评价值D，并根据D值进行综合性状分析，进而得知：新春17号相对耐低磷，其次为中麦175、甘春26号、陇春27号、西旱3号、陇春23号、陇春9786、宁春4号和西旱2号相对为磷敏感的小麦材料。

表5 供试品种的综合性状指标、权重、μ（X）及综合评价值（D）Table 5 Comprehensive trait indicators，weights，μ（X） and comprehensive evaluation values （D） of varieties

采用平方欧式距离法对供试小麦品种各性状的D值进行聚类分析（图1），欧式距离为 3时可将其划分为3个等级，第Ⅰ类为新春17号、中麦175与甘春26号这3 份材料，D值分别为0.80、0.78 和0.73；第Ⅱ类为陇春27 号、西旱3 号和陇春23 号，D值分别为0.53、0.51和0.48；第Ⅲ类陇春9786、西旱2号和宁春4号这3份材料，D值分别为0.41、0.39和0.37。

图1 小麦材料苗期的耐低磷性聚类图Figure 1 Cluster diagram of low-phosphorus tolerance of wheat materials at seedling stage

综上所述，通过结合聚类分析和各个材料的综合评价值D值最终筛选出耐低磷基因型的材料新春17号和中麦175。

2.4 不同施磷水平下所筛小麦品种苗期性状差异

对筛选的耐低磷小麦材料：新春17 号和中麦175，磷敏感材料：西旱2号和宁春4号的苗期生长性状进行比较分析（图2）。在低磷胁迫下，地上干质量和叶绿素含量均低于正常施磷水平，其中，在地上干质量中，宁春4号在不同施磷水平下差异显著，低磷胁迫较对照降低23.62%，叶绿素含量中西旱2 号和宁春4 号差异均显著，低磷处理较对照分别下降24.75%和13.01%。在苗长中，新春17 号和宁春4号在不同施磷水平差异均显著，且低磷胁迫的苗长较正常施磷水平分别高20.00%和18.72%。新春17号，中麦175和西旱2号在低磷胁迫处理下的地下干质量高于正常施磷水平，分别高15.79%、1.25%和16.67%，宁春4 号胁迫处理下较正常磷低39.84%，达到显著水平。在根体积中，中麦175在低磷胁迫下较正常施磷高37.64%，达到显著水平，而新春17 号在两处理间差异不大，在根表面积中，材料新春17号和中麦175在两处理间差异不大。西旱2号和宁春4号在胁迫处理下根体积和根表面积均低于正常供磷水平，根体积降低52.77%和20.03%，根表面积降低33.78%和32.94%，均达到显著水平。综上所述，新春17号和中麦175的苗期各生长性状在低磷胁迫下与正常供磷水平相比较，差异不大或高于正常供磷水平，而西旱2 号和宁春4 号的差异较大，且较多低于正常供磷水平，在根系部的生长性状上体现较为突出。因此，新春17 号和中麦175 为耐低磷基因型材料，西旱2号和宁春4号为磷敏感型材料。

3 讨论

采用综合指标对作物的抗逆能力的评价在水稻［16］、苜蓿［17］、谷子［18］中等已被常用，苑乂川［18］在谷子苗期耐低磷种质的筛选中用隶属函数法对所测定的160 份材料的苗期株高、根长、地上鲜质量、地下鲜质量、叶长、叶宽、茎粗、地上磷含量、地下磷含量、地上干质量和地下干质量等11个指标的耐低磷系数通过主成分分析得到4个相互独立的综合指标，前4个主成分的累计贡献率为83.05%，代表原指标的极大部分的信息，利用4个相互独立的综合指标对不同谷子的耐低磷特性进行客观的评价分析。在本研究中，通过对耐低磷系数的主成分分析，将小麦苗期所测定的地上干质量、叶绿素含量、苗长、地下干质量、根体积、总根长、根表面积和根投影面积这8个性状指标分别转化为3个综合指标，前3个主成分的累计贡献率为87.01%，使评价工作简化且客观准确，然后采用隶属函数法对各小麦品种苗期的耐低磷特性进行评价，避免了单个指标描述耐低磷特性的局限性。

刘厚诚与刘富贵研究表明，低磷胁迫会严重影响植株地上部分的生长，叶面积的减少，株高下降，地上部分以及地下部分干物质重量的下降［19-20］。但是在本研究中，苗长的耐低磷系数除陇春49和甘春26 号小于1 外，其余小麦品种苗长的耐低磷系数均大于1，表明在低磷胁迫处理下苗长高于正常磷处理，这与前人的研究结果相悖，可能是由于在处理20 d 取样测其性状有关，小麦种子所含磷素可能会影响小麦苗长。前人研究表明，供磷水平过低会抑制植物的生长，主要表现为生物量减少等。良好的根系是植物适应低磷环境的重要条件，根系在抵抗低磷胁迫环境压力时可以产生可塑性的变化［21-22］。本研究中，在低磷处理下小麦的地上部分的生长均受到胁迫影响，地下干质量耐低磷系数大的品种地上干质量的耐低磷系数值也较大，根系的生长状况对地上部生长至关重要。因此，根系部的生长状况对品种耐低磷的特性有很大的影响，这与前人的研究结果一致。本研究初步探究了供试小麦材料的耐低磷的能力，但若要将其用于农业生产上，还需要进一步进行大田试验和全生育期特征特性的比较与验证。