麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠组织通透性的影响

谢慧臣,冉云,张云,欧阳瑜,唐浪,吴广阳

(1.湖北民族大学 中医药学院,湖北 恩施 445000;2.恩施德元升中医医院 中医科,湖北 恩施 445000)

麸炒法是中药传统炮制工艺,又称麦麸炒或麸皮炒,其炮制方法是将切制或净制后的中药加相应比例的麦麸拌炒至药材表面呈金黄色时取出,筛去麸皮,放凉备用。目前麸炒法的作用机理研究使人们对其影响中药疗效的机理有了一定的认识［1］。苍术是应用麸炒法的典型常用中药,具有健脾、燥湿、祛风、散寒、解郁、辟秽等功效。麸炒苍术与生苍术功效有所差异,其原因是麸炒后苍术化学成分及含量发生了较大变化［2］。尽管苍术临床应用广泛,目前对苍术的研究主要集中在不同的炮制方法下其活性成分种类及化学成分的变化方面,而对苍术药理作用的实验研究还较为欠缺,尤其缺乏细胞与分子层面的研究,且对其单体有效成分的药理研究尚属空白［3］。本研究以脾虚证大鼠为模型,从结肠组织通透性及CAM-MLCK信号通路入手进行实验,以期从结肠黏膜屏障的损伤与修复过程途径阐明苍术麸炒后改善脾虚证候的药理作用机制,为后续麸炒苍术单体成分的进一步研究及临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 实验动物

SD雄性大鼠60只,3～4月龄,体质量为(150±20)g,购自武汉子科恒生物科技有限公司［动物生产许可证号:SCXK(鄂)20190116,使用许可证号:SYXK(鄂)2020-0203］。本研究已通过湖北民族大学伦理委员会审批(审批号:2019054)。常规喂养,自由进食水。

1.1.2 药物与试剂

中药购自湖北省恒信医药有限公司。苦寒破气方药液配制方法:厚朴、枳实、大黄的用药质量比为5∶3∶4,常规煎煮2次;麸炒苍术药液配制方法:苍术饮片洗净干燥,先后加入10倍体积和8倍体积蒸馏水煎煮2次,45 min/次,滤液合并浓缩。苦寒破气方浓缩液生药质量浓度为2 g/mL,麸炒苍术生药质量浓度1 g/mL,低温保存,使用时加入蒸馏水稀释至适当质量浓度。复方谷氨酰胺肠溶胶囊(批号:200104)购自地奥集团成都药业股份有限公司。

闭锁连接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1,批号:B3305)、密封蛋白-1(Claudin-1,批号:B2021)、密封蛋白-2(Claudin-2,批号:B2022)、闭合蛋白(Occludin)ELISA试剂盒(批号:B2040)购自上海信帆生物科技有限公司;磷酸化丝裂原细胞外激酶1/2(phosphorylated mitogen extracellular kinase1/2,p-MEK1/2)一抗(批号:G3125)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase1/2,p-ERK1/2)一抗(批号:G2014)、荧光二抗(批号:GB25021)、磷酸化蛋白酶抑制剂(批号:G2301)、肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK,批号:G3412)、钙调蛋白(calmodulin,CAM)兔抗鼠免疫球蛋白(IgG)多克隆抗体(批号:G2361)、免疫荧光染色试剂盒(批号:F2021)、DAB显色剂(批号:G32415)购自武汉塞维尔生物科技有限公司;RNA提取液(批号:J312546)购自Servicebio;HyPureTMMolecular Biology Grade Water(批号:J413261)购自HyClone;Trizol(批号:J402134)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(批号:J265143)引物购自Thermo。引物序列见表1。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.1.3 仪器

Stepone plus GC-1500 型荧光定量PCR仪(ABI)、D3024R台式高速冷冻型微量离心机(DragonLab)、Rt2100c酶标检测仪(Rayto)、alphaEaseFC灰度分析软件(Alpha Innotech)、Adobe PhotoShop图像分析软件(Adobe)、NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo)、NE600光学显微镜、XK-S2000D荧光显微镜购自西尼科光学仪器有限公司;AutoLumo A2000Plus化学发光仪购自郑州安图生物工程股份有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组、造模与给药方法

适应性喂养7 d,所有大鼠随机分为6组:正常组(CON)、脾虚证模型组(MOD)、麸炒苍术高、中、低剂量组(BRA-H、BRA-M、BRA-L)、复方谷氨酰胺组(CG),10只/组。除CON组外,其余大鼠均以慢性束缚、苦寒破气加饥饱失常法建立脾虚证大鼠模型［4-5］。每kg大鼠每日以生药20 g灌服苦寒破气方1次,束缚架捆绑束缚3 h,后喂饲料(常规量的一半,隔日1次),持续21 d。造模结束后的第2天开始灌胃治疗。根据体表面积公式换算,BRA-L、BRA-M、BRA-H组每kg大鼠每日中药灌胃量分别为5、10、20 g,CG组为9 mg复方谷氨酰胺配制成的溶液2 mL;CON和MOD组予等体积生理盐水进行灌胃,持续14 d。

1.2.2 观察结肠组织病理改变

治疗结束后,各组大鼠禁食不禁水24 h,腹腔注射麻醉后,剖开胸腹腔,心脏采血6 mL,离心,取上清液,-80 ℃保存;切取部分结肠组织,液氮保存;再取部分使用4%多聚甲醛固定液固定,经脱水和石蜡包埋后切片,常规HE染色,光镜下观察结肠组织病理学改变。另取部分使用透射电镜观察细胞超微病理学变化,步骤如下:戊二醛前固定→漂洗→脱水→包埋→超薄切片→铀、铅染色→电镜观察。

1.2.3 Elisa法检测结肠黏膜组织ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的质量分数

低温下取结肠组织一块,冰生理盐水洗净滤干,9倍体积生理盐水匀浆,低温高速离心(4 ℃ 3 500 r/min)10 min,收集细胞上清液,使用Elisa法检测结肠黏膜组织ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的质量分数。

1.2.4 免疫荧光法检测结肠黏膜组织细胞p-MEK1/2、p-ERK1的蛋白分布及表达

取冷冻结肠组织一块,切片(厚度约200 μm),37 ℃烘烤过夜,脱蜡,柠檬酸缓冲液修复,PBS缓冲液冲洗2次,加一抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶200;Vp-ERK1∶VPBS=1∶200)孵育过夜;PBS缓冲液冲洗2次,二抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶400;Vp-ERK1∶VPBS=1∶400)孵育30 min;PBS缓冲液冲洗2次,加染液染色,CO2孵箱孵育30 min;PBS缓冲液冲洗3次,封片,荧光标记后使用荧光显微镜连续摄取图片采集图像,Adobe PhotoShop图像分析系统测定并分析荧光强度。

1.2.5 免疫组化法检测结肠组织细胞MLCK、CAM的蛋白表达

取结肠组织一块,4%多聚甲醛溶液固定,包埋,按照免疫组织化学SABC法步骤操作,切片放入3%H2O2溶液10 min,蒸馏水冲洗3次,PBS缓冲液行微波修复,滴加5%BSA封闭液,37 ℃反应30 min,滴加MLCK、CAM一抗(VMLCK∶VPBS=1∶200;VCAM∶VPBS=1∶200),4 ℃反应过夜,PBS缓冲液冲洗3次,滴加二抗(Vp-MEK1/2∶VPBS=1∶400;Vp-ERK1∶VPBS=1∶400),37 ℃反应30 min,PBS缓冲液冲洗3次,滴加SABC,PBS冲洗3次,DAB显色,苏木素复染后蒸馏水洗涤,37 ℃恒温过夜,封片。使用光学显微镜观察各组大鼠结肠组织细胞MLCK、CAM蛋白表达。运用Image-ProPlus软件采集图像并定量分析免疫组化结果,以平均光密度值表达,MLCK、CAM阳性染色为棕色或棕黄色。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测结肠组织细胞的MLCK、CAMmRNA表达

取匀浆管,加入1 mL Trizol Reagent,置冰上预冷;取100 mg结肠组织,加入匀浆管中,匀浆仪充分研磨,离心取上清;加入250 μL三氯甲烷,充分混匀静置,取上清;加入异丙醇混匀,离心,吸除上清;乙醇洗涤沉淀,离心,吸除上清;加水溶解RNA,孵育5 min;Nanodrop 2 000检测RNA浓度及纯度,抽提总RNA。取10 μL RNA溶液,加入1 μL oligo(dT)18,4 μL 5× Reaction Buffer,2 μL 10 mmol/L dNTP Mix,1 μL RiboLock RNAase抑制剂(20 U/μL)和1 μL RevertAi M-MuLV 逆转录酶(200 U/μL),进行反转录。取0.2 mL PCR管,配制如下反应体系:2× qPCR Mix 12.5μL,7.5 μmol/L基因引物2.0 μL,反转录产物2.5 μL,ddH2O 8.0 μL,定量PCR。预变性95 ℃,10 min,循环95 ℃,15 s→60 ℃,60 s(40次),熔解曲线60 ℃→95 ℃,每15 s升温0.3 ℃,进行PCR扩增。对结果进行如下处理:采用ΔΔCT法,即2-K计算目的基因的相对表达量,K=［CT(待测样本,目的基因)-CT(待测样本,内标基因)］-［CT(对照样本,目的基因)-CT(对照样本,内标基因)］。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 脾虚证大鼠模型构建情况

造模期间每天观察各组大鼠精神状态、毛发色泽、修饰行为及大便性状等的变化。结果发现,CON组大鼠精神状态良好,行为活跃,反应灵敏,毛发光泽,大便质地正常。造模大鼠第1周开始逐渐出现活动减少、扎堆懒动、大便渐稀等表现,第2～3周活动进一步减少,倦怠蜷卧等表现日益明显,毛色逐渐泛黄、黯淡稀疏无光,食量进一步下降,体质量明显减轻,唇色逐渐变淡,大便稀溏不成形且肛周污秽,提示脾虚证大鼠模型构建成功。

2.2 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠组织病理学的影响

光镜观察各组大鼠结肠组织HE染色后的微观结构变化。CON组结肠黏膜上皮及固有层基本完整;MOD组结肠黏膜上皮水肿、变性、糜烂、坏死,固有膜结构破坏、崩解,毛细血管充血明显,溃疡形成;各治疗组结肠黏膜上皮结构不同程度修复,水肿减轻,毛细血管充血不同程度下降,炎性细胞分布范围不同程度缩小,其中BRA-H组修复效果最为明显(图1)。

透射电镜观察各组大鼠结肠组织细胞超微结构改变。CON组结肠壁细胞呈椭圆形,胞膜及胞核正常,胞内线粒体形态多数正常;MOD组结肠上皮细胞坏死肿胀,细胞间隙增宽,胞质空泡样变,胞内线粒体数量明显下降且结构异常,连接复合体消失,线粒体固缩伴空泡化,嵴断裂,分泌小管不完整;各治疗组结肠组织细胞超微结构不同程度改善,其中BRA-H组修复效果最为明显,与CON组比较无明显差别(图2)。

图1 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠组织病理学的影响(HE染色,×200)

图2 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠组织细胞超微病理学的影响(×8 000)

2.3 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠黏膜组织ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin的影响

与CON组比较,MOD组结肠黏膜组织ZO-1、Claudin-1、Occludin的质量分数显著降低,Claudin-2的质量分数显著升高 (P<0.01);与MOD组比较,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG组ZO-1、Claudin-1、Occludin的质量分数显著升高,Claudin-2的质量分数显著降低(P<0.05,P<0.01);与CG组比较,BRA-H组ZO-1、Claudin-1、Occludin的质量分数显著升高,Claudin-2的质量分数显著降低(P<0.05,P<0.01);与BRA-L组比较,BRA-H组ZO-1、Claudin-1、Occludin的质量分数显著升高,Claudin-2的质量分数显著降低,且呈量效对应关系(P<0.05,P<0.01,表2)。

表2 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠黏膜组织ZO-1、Claudin-1、Claudin-2、Occludin质量分数的影响Table 2 Effects of bran-fried Rhizoma Atractylodis on mass fraction of ZO-1,Claudin-1,Claudin-2,and Occludin in colon mucosa of rats with spleen deficiency syndrome

2.4 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠黏膜组织p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表达的影响

与CON组比较,MOD组结肠黏膜组织p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表达的荧光强度显著增强 (P<0.01);与MOD组比较,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG组p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表达的荧光强度显著降低(P<0.05,P<0.01);与CG组比较,BRA-M、BRA-H组p-MEK1/2、p-ERK1荧光强度显著降低 (P<0.05,P<0.01);与BRA-L组比较,BRA-M、BRA-H组p-MEK1/2、p-ERK1荧光强度显著降低,且呈量效对应关系(P<0.05,P<0.01,图3)。

2.5 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠组织细胞中MLCK、CAM蛋白表达的影响

与CON组比较,MOD组结肠组织MLCK蛋白表达水平显著升高,CAM蛋白表达显著降低 (P<0.01);与MOD组比较,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG组MLCK蛋白表达水平显著降低,CAM蛋白表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01);与CG组比较,BRA-M、BRA-H组MLCK蛋白表达水平显著降低,CAM蛋白表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01);与BRA-L组比较,BRA-M、BRA-H组MLCK蛋白表达水平显著降低,CAM蛋白表达水平显著升高,且呈量效对应关系(P<0.05,P<0.01,图4)。

A:各组大鼠结肠黏膜组织p-MEK1/2蛋白荧光染色结果(×400);B:各组大鼠结肠黏膜组织p-ERK1蛋白荧光染色结果(×400);C:各组大鼠结肠黏膜组织p-MEK1/2蛋白荧光强度水平各组大鼠结肠黏膜组织p-ERK1蛋白荧光强度水平与CON组比较,P<0.01;2)与MOD组比较,P<0.05;3)与MOD组比较,P<0.01

2.6 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠组织中MLCK、CAM mRNA表达的影响

与CON组比较,MOD组结肠组织中MLCKmRNA表达显著升高,CAMmRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01);与MOD组比较,BRA-L、BRA-M、BRA-H及CG组MLCKmRNA表达显著降低,CAMmRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与CG组比较,BRA-H组MLCKmRNA表达显著降低,CAMmRNA表达显著升高(P<0.05,P<0.01);与BRA-L组比较,BRA-M、BRA-H组MLCKmRNA表达显著降低,CAMmRNA表达显著升高,且呈量效对应关系(P<0.05,P<0.01,表3)。

A:各组大鼠结肠组织CAM免疫组化染色结果(×400);B:各组大鼠结肠组织MLCK免疫组化染色结果(×400);C:各组大鼠结肠组织CAM蛋白平均光密度值各组大鼠结肠组织MLCK蛋白平均光密度值与CON组比较,P<0.01;2)与MOD组比较,P<0.05;3)与MOD组比较,P<0.01

表3 麸炒苍术对脾虚证大鼠结肠组织中MLCK、CAM mRNA表达的影响Table 3 The effects of bran-fried Rhizoma Atractylodis on MLCK and CAM mRNA expression in colon tissue of rats with spleen deficiency syndrome

3 讨论

脾虚证为临床常见中医证候,常表现出全身性病理状态,其动物模型制备一直备受关注,目前一般认为多因素复合造模方法更接近临床实际情况［6］。中医认为,苦寒伤中、情志失调和饮食失节易致脾虚［7］。本研究采用慢性束缚、苦寒破气加饥饱失常复合造模方法构建脾虚证大鼠模型。结果发现,脾虚证模型大鼠结肠病理情况明显异常,光镜下黏膜上皮水肿、变性、糜烂、坏死;透射电镜下上皮细胞坏死肿胀、细胞间隙增宽,与正常大鼠比较差异明显,说明了上述脾虚证造模方法的科学性。

苍术为菊科植物北或茅苍术的干燥根茎,味甘、苦,性温,归脾、肾、肝经,具燥湿健脾、祛风散寒、明目之功效。从炮制作用看,生品辛温苦燥,麸炒可缓和燥性使其气变芳香,增加健脾燥湿作用［8］。研究表明,苍术具有健胃的作用,其丙酮提取物、β-桉叶醇和茅苍术醇对豚鼠回肠卡巴胆碱收缩呈明显的对抗作用［9］。此外,苍术的正丁醇萃取物对醋酸型、酒精型、幽门结扎型及吲哚美辛型胃溃疡均有明显的抑制作用,其作用机理可能与增多胃内PGE2含量,促进DNA、RNA及蛋白质的合成和改善溃疡病灶血循环相关［10］。亦有研究表明,麸炒苍术增效的机理可能与苍术麸炒后对肠道菌群和机体代谢的调节作用增强及白术内酯Ⅰ含量增加有关［11］。本研究结果显示,光镜下,各治疗组结肠黏膜上皮被破坏的结构有不同程度修复,透射电镜下,各治疗组结肠组织细胞超微结构不同程度改善,其中尤以麸炒苍术高剂量组改善最为显著,表明麸炒苍术可较好地修复脾虚证大鼠受损的肠黏膜。

肠黏膜屏障由机械、化学、免疫、生物等屏障构成,其中肠黏膜上皮细胞间的紧密连接蛋白是肠黏膜机械屏障的主要结构,其组成包括Occludin、Claudins、JAM-A等跨膜蛋白和MAGI1、ZO-1等支架蛋白［12-13］。Claudins作为主要骨架蛋白支撑紧密连接形成致密的复合体,保持肠黏膜防御屏障的完整性［14-15］。Claudin-1属于闭锁蛋白,可防止肠黏膜液体流失及大分子弥散,保持肠上皮稳态［16］。Occludin也属于跨膜闭合骨架蛋白,对肠黏膜紧密连接有一定影响［17］。ZO-1是紧密连接的支架蛋白,具有桥梁蛋白的作用,与Occludin、Claudin-1结合,可使后两者与肠黏膜细胞的骨架紧密结合［18］。Claudin-2在漏孔上皮中高表达,是一种孔道形成蛋白,可通过调节内皮及上皮细胞的通透机制达到调节肠屏障功能的作用［19］。本研究发现,脾虚证模型大鼠结肠组织中Claudin-1、ZO-1、Occludin表达水平明显下降,Claudin-2表达水平明显升高;麸炒苍术干预后,ZO-1、Claudin-1、Occludin表达水平上调,同时Claudin-2表达水平下降,其中尤以麸炒苍术高剂量组变化最为明显,表明麸炒苍术可通过上调结肠紧密连接相关蛋白,下调Claudin-2的表达水平,双相有机调节肠道间紧密连接相关蛋白,降低结肠细胞通透性,修复受损肠黏膜。

MEK是分裂原活化抑制剂,其主要作用是抑制MAP激酶［20］。ERK为蛋白激酶,是将信号从表面受体传导至细胞核的关键,磷酸化激活的ERKl/2由胞质转位到核内,进而介导NF-κB、Ap-1、c-fos等的转录活化,参与细胞增殖、分化、细胞形态维持、细胞骨架构建、细胞凋亡和细胞恶变等多种生物学反应［21］。CAM-MLCK通路对平滑肌细胞收缩具有调节作用,可调节结肠平滑肌的信号传导,许多细胞内生理过程都有CAM的参与［22］。MLCK是一种蛋白激酶,与肠黏膜屏障的损伤和修复均有密切关系,研究已表明下调MLCK磷酸化可修复受损的肠黏膜［23］。MEK/ERK信号级联通路对MLCK的磷酸化具有调控作用,可通过激活MLCK,收缩内皮细胞,增大细胞间隙促进受损肠黏膜的修复［24］。本研究发现,与正常组比较,脾虚证模型大鼠结肠组织CAM蛋白和基因表达下降,MEK/ERK/MLCK信号通路被激活;p-MEK1/2、p-ERK1蛋白分布及表达、MLCK蛋白和基因表达明显升高。研究结果提示,麸炒苍术可通过上调CAM蛋白和基因表达,降低内脏高敏感性,抑制肠道平滑肌细胞收缩,调节正常胃肠激素分泌,促进胃肠平滑肌蠕动,并调控相关胃肠激素及抑炎或促炎因子分泌。此外,麸炒苍术还可抑制MEK/ERK/MLCK信号通路活化并进一步提升细胞修复能力,增强肠上皮细胞屏障,降低脾虚证大鼠结肠黏膜炎症水平,保护结肠上皮,改善脾虚证模型大鼠结肠组织细胞的病理状态,进而调控相关胃肠激素及抑炎或促炎因子分泌。

作者贡献声明

谢慧臣:提出研究思路和框架,设计实验,统计分析数据,实施动物实验,撰写及修改论文;冉云:提出研究思路和框架,设计实验,统计分析数据;张云、欧阳瑜:提供研究方向与论文修改建议;唐浪、吴广阳:参与动物实验。

利益冲突声明

本研究未受到企业、公司等第三方资助,不存在潜在利益冲突。