纤维素酶的低共熔溶剂双水相萃取研究

付玉洁,于海龙

(青岛科技大学 化工学院,山东 青岛 266042)

基于预处理、酶水解等过程的糖平台转化技术可将农林生物质资源转化为各种燃料、化学品和材料,是我国能源发展战略的重要内容,对国家“乡村振兴”“碳中和”等重大战略的成功实施有积极推动作用[1-3]。然而,传统纤维素酶水解反应是在p H=4.8的酸性缓冲液体系中进行的,这并不是酶发挥催化活性的最佳反应溶剂,并且酶在缓冲体系中存在稳定性低、易失活、难回收等问题。寻找新型绿色溶剂体系改善酶的活性、稳定性和可回收性,是突破农林生物质资源糖平台转化技术瓶颈,加速其工业化生产的根本举措。

相比于传统溶剂和离子液体,低共熔溶剂(DES)具有易制备、非挥发、低毒性、可再生、可设计、可生物降解、可循环使用等众多优点,被认为是绿色和可持续工业中最有应用潜力的新型溶剂[4-5]。DES酶促反应技术是继常规水溶液酶促反应和有机相酶促反应发展起来的新型酶促反应技术,具有生物相容性好、酶结构稳定的特性,有助于解决目前酶催化工业上因环境不匹配带来的应用瓶颈,为酶催化反应提供一个真正合适的介质环境[6-7]。研究表明,DES强大的氢键网络结构可以稳定蛋白质分子构象,提高酶的催化活性和稳定性[8-9],常见酶系如脂肪酶、蛋白酶和水解酶在DES中均表现出较好的反应活性[10-12],在纤维素酶水解糖化方面具有巨大的应用潜力,但相关技术亟需开发。并且利用DES作为成相剂所构建的DES双水相体系有效地结合了DES和双水相萃取技术的优点,在纤维素酶回收再利用方面拥有巨大潜力。因此设计DES水解体系,是解决酶水解效率低、稳定性差和酶回收难的有效措施。

本工作制备了不同的氯化胆碱基低共熔溶剂,通过对DES体系下纤维素酶活性进行测定,筛选出能够增强纤维素酶活性的DES 体系,并构建DES双水相系统对纤维素酶进行回收,并通过紫外光谱、荧光光谱、电导率仪和动态激光散射仪揭示萃取机理。研究结果可为寻找改善酶的活性和可回收性的新型绿色溶剂体系提供重要的理论依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

纤维素酶1.5L,青岛吉宝生物科技有限公司;氯化胆碱(Ch Cl),国药集团化学试剂有限公司;聚乙二醇200(PEG200),国药集团化学试剂有限公司;考马斯亮蓝G250,国药集团化学试剂有限公司;无水磷酸氢二钾,国药集团化学试剂有限公司。

电热恒温鼓风干燥箱,DHG-9146A 型,上海精宏实验设备有限公司;智能磁力搅拌器,ZNCL-TS型,郑州予科仪器设备有限公司;电导率仪,DDS-307A 型,上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 低共熔溶剂的制备

将甘油、乙二醇、聚乙二醇200、乳酸、草酸或冰乙酸与氯化胆碱按一定的物质的量的比(2∶1、1∶1、1∶2、1∶3或1∶4)混合,在80℃下加热并不断搅拌,直至形成无色透明液体;并通过测定DES水溶液中纤维素酶活性筛选合适的溶剂。

1.3 DES体系下水解玉米秸秆

准确称量1 g过孔径0.4 mm 筛的玉米秸秆粉末(绝干),将其加入到含有50 mL 质量分数10%DES水溶液或0.01 mol·-1醋酸缓冲液(p H4.8)的锥形瓶中,放入恒温震荡摇床中在50℃和150 r·min-1下水解96 h。水解中纤维素酶用量为9 FPU·g-1,纤维二糖酶用量50 U·g-1。分别在0、3、6、9、12、24、36、48、72、96 h 时定时取样,经5 000 r·min-1离心5 min后用0.22μm 针式过滤器过滤后通过高效液相色谱检测葡萄糖含量。

1.4 纤维素酶的回收

取适量DES、纤维素酶和一定浓度的K2HPO4水溶液混合,混合物在500 r·min-1下搅拌使其充分混合后,在25℃下萃取30 min。记录上下两相的体积,并用考马斯亮蓝法测定上下两相中的蛋白含量。萃取率计算公式如下:

其中,F代表上相萃取效率;ρt和ρb代表上下两相中的纤维素酶浓度;Vt和Vb分别代表上下两相的体积。

1.5 结构表征

1.5.1 DES体系下纤维素酶的构象研究

使用日立F-4600型荧光光谱仪对样品扫描,采用1 cm 石英比色皿,狭缝宽度为10 nm,激发波长280 nm,波长扫描速度为1 200 nm·min-1,扫描波长为300～540 nm;采用英国应用光物理Chirascan Plus型圆二色谱仪扫描样品,狭缝宽度为1 nm,扫描速度为50 nm·min-1,扫描光程为0.2 cm,扫描波长为近紫外区190～250 nm。

1.5.2 双水相萃取纤维素酶的机理研究

通过紫外光谱及荧光光谱测试探究萃取前后纤维素酶构象的变化;并为了进一步研究纤维素酶的萃取机理,利用电导率仪和动态激光散射仪(DLS)考察低共熔溶剂富集相的微观结构。

2 结果与讨论

2.1 DES体系下纤维素酶活性

为试验方便,选取在室温下仍能保持液体状态的DES进行研究,并考虑到DES黏度较高的缺陷,将其配置成10%的DES水溶液(V/V,p H=4.8)使用。考察了不同DES水溶液体系对于纤维素酶活性的影响,见图1。从图1可以看出,n(ChCl)/n(G)=1/4和n(ChCl)/n(PEG200)=1/3对纤维素酶的活性有增强作用,分别提高了11.27%和4.64%;而其他低共熔溶剂对纤维素酶活性几乎没有增强作用,甚至会使纤维素酶活性明显下降。因此,选择n(ChCl)/n(G)=1/4和n(ChCl)/n(PEG200)=1/3进行后续研究。

图1 DES体系下纤维素酶的活性Fig. 1 Activity of cellulase in DES system

为进一步寻找合适的DES水溶液体系,考察了DES浓度对于纤维素酶活性的影响见图2。从图2中可以看出,随着DES含量的不断增加,纤维素酶活性先增强后减弱。其原因可能是DES体积分数在10%以下时,低共熔溶剂的氢键网络结构可以稳定纤维素酶分子构象,使纤维素酶的催化活性增强;而当DES体积分数超过10%以后,DES含量的增多使得体系的黏度增大,阻碍了纤维素酶与底物的接触,从而使其活性减弱。

图2 DES浓度对纤维素酶活性的影响Fig. 2 Effect of DES concentration on cellulase activity

DES体系下纤维素酶的水解糖化性能研究见图3。以玉米秸秆作为底物,探究DES体系下纤维素酶水解玉米秸秆的葡萄糖产率。其中纤维素酶用量为9 FPU·g-1,纤维二糖酶用量为50 U·g-1。从图3中可以看出,纤维素酶对玉米秸秆显示非常低的水解糖化效率,水解96 h后葡萄糖水解得率为35.39%,说明纤维素酶的活性低,极大地抑制了酶解。DES体系下,由于DES 的氢键网络结构可以稳定蛋白质分子构象,提高酶的催化活性和稳定性,酶解得到了明显的改善。10%n(ChCl)/n(G)=1/4水溶液体系下,纤维素酶的水解葡萄糖得率最高,水解96 h达到41.14%;10%n(ChCl)/n(PEG200)=1/3水溶液体系下,水解96 h葡萄糖得率次之,为37.76%。上述结果表明,DES 水溶液体系可以有效的提高玉米秸秆的水解葡萄糖得率。

图3 纤维素酶水解玉米秸秆的水解葡萄糖得率Fig. 3 Glucose yield from cellulase hydrolysis of corn stover

2.2 双水相萃取条件优化

为了实现纤维素酶的回收使用,利用DES 与K2HPO4构建双水相体系对纤维素酶进行萃取。由实验得知,与n(ChCl)/n(G)=1/4 相比,n(Ch Cl)/n(PEG200)=1/3更易与K2HPO4溶液形成双水相。由于萃取条件对双水相萃取有显著影响,从而影响双水相体系对于纤维素酶的萃取。因此本实验考察了盐浓度、DES用量、纤维素酶质量、萃取时间和温度等因素对双水相体系萃取纤维素酶的影响。

图4考察了K2HPO4浓度对纤维素酶萃取率的而影响。如图4所示,随着K2HPO4浓度的继续增加,纤维素酶的回收率逐渐增加,在K2HPO4浓度为0.25 g·m L-1时回收率达到最大值69.53%;这主要是由于盐析作用,下相中的盐离子与纤维素酶之间存在结合水分子的竞争关系,因此无机盐质量的增加会导致纤维素酶在下相的溶解度降低,使其回收率增大。但是当体系中K2HPO4的浓度超过0.25 g·L-1时,纤维素酶的回收率随着盐浓度的增加而迅速降低;这是因为纤维素酶表面存在水化层,且水分子与纤维素酶表面氨基酸残基之间的氢键作用是蛋白质分子保持形貌和活性的重要作用力,而盐浓度的进一步增加会引起上相含水量的降低,从而使上相中的纤维素酶含量降低,回收率下降。因此体系中K2HPO4的最佳浓度为0.25 g·m L-1,它将在后续工作中继续使用。

图4 K2 HPO4 浓度对纤维素酶萃取率的影响Fig. 4 Effect of K2 HPO4 concentration on extraction rate of cellulase

图5考察了DES浓度对纤维素酶萃取率的影响。从图5可以看出,当体系中DES的体积分数从30%增加到35%时,纤维素酶的回收率持续增加并达到最大值73.89%;这主要是随着DES体积分数的增加,更多的DES胶束在上相中形成,有利于结合更多的纤维素酶。而当DES 的体积分数超过35%时,纤维素酶的回收率表现出下降趋势;这是由于随着DES的进一步增加,上相的黏度逐渐增加,阻碍了纤维素酶进入上相。因此在后续试验中DES的体积分数为35%。

图5 DES浓度对纤维素酶萃取率的影响Fig. 5 Effect of DES concentration on extraction rate of cellulase

温度是纤维素酶萃取过程中一个重要的影响因素。考察了萃取温度对于纤维素酶萃取率的影响见图6。从图6可以看出,温度低于25℃时,纤维素酶的回收率逐渐升高;这是由于随着温度的升高,DES富集相的黏度逐渐降低,并且两相之间的界面阻力下降,从而能够使纤维素酶快速进入上相。当温度超过25℃时,纤维素酶的回收率急剧下降;这是因为温度超过某一特定值时,纤维素酶表面氨基酸基团和水分子之间作用力减弱,不利于其结合DES进入上相。由此,确定最佳萃取温度为25℃。

图6 温度对纤维素酶萃取率的影响Fig. 6 Effect of temperature on extraction rate of cellulase

图7和图8分别考察了萃取时间和纤维素酶浓度对于纤维素酶萃取率的影响。如图7所示,纤维素酶的回收率随着萃取时间的增加而逐渐增加,当萃取时间超过30 min后,回收率增加缓慢并且基本保持不变。并且随着纤维素酶用量的不断增加,回收率逐渐降低(图8)。这都表明了双水相体系萃取的容量有限,随着纤维素酶用量的持续增加或者萃取时间的延长,上相基本达到饱和状态后,以至于没有更多的空间容纳纤维素酶,导致其进入下相,从而使回收率下降。

图7 时间对纤维素酶萃取率的影响Fig. 7 Effect of time on extraction rate of cellulase

图8 酶浓度对纤维素酶萃取率的影响Fig. 8 Effect of enzyme concentration on extraction rate of cellulase

总之,当双水相体系中的K2HPO4浓度为0.25 g·m L-1、DES体积分数为35%,在25℃下对较少纤维素酶萃取30 min时,可以对纤维素酶获得良好的萃取效果。

为了实现纤维素酶水解后的重复使用,利用DES双水相体系对水解液中的纤维素酶进行回收。最优条件下对水解液中纤维素酶的回收效果见表1。从表1中可以看出,水解液中94.24%的纤维素酶被萃取上相,而仅有27.82%的葡萄糖随之进入。这表明双水相体系可以有效的将纤维素酶与葡萄糖分离,实现对纤维素酶的回收利用;并且回收后纤维素酶的活性仍能保持90%以上,这也表明了双水相体系萃取能够为纤维素酶提供一个温和的环境。

表1 双水相萃取结果Table 1 Aqueous two-phase extraction results

2.3 结构表征

2.3.1 DES体系下纤维素酶构象的测定

为探究DES体系为何有利于纤维素酶活性的增强,通过荧光光谱和圆二色谱对纤维素酶构象进行表征。

在天然蛋白质中,能产生荧光的芳香氨基酸残基包括色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)。它们通常位于蛋白质的三维结构内,被各种非极性氨基酸残基所包围。因此,它们所处的局部环境比蛋白质分子外的水溶液的极性小。如果将它们移到蛋白质的外部,暴露在外部极性很强的水溶液中,就会发生荧光猝灭现象。色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸相对荧光强度之比为100∶9∶0.5。色氨酸的荧光强度最高,在荧光光谱中会覆盖其他氨基酸残基的吸收峰,表现为一宽峰。图9所示为DES体系下纤维素酶的荧光光谱。在340 nm 处的荧光峰为3种芳香族氨基酸残基的复合峰。酶在DES水溶液中产生荧光猝灭效应(荧光强度降低),并发生蓝移。表明Trp、Tyr和phe向纤维素酶表面移动,有利于其与底物的接触,从而使得其水解糖化能力增强。

图9 DES体系下纤维素酶的荧光光谱Fig. 9 Fluorescence spectra of cellulase in DES system

圆二色谱(CD)被广泛应用于测量蛋白质的二级结构和推测蛋白质的三级结构。天然纤维素酶和修饰纤维素酶的CD 光谱如图10所示。天然纤维素酶在210 nm 处有一个宽峰,表明其三级结构符合“α+β”型[13]。处于DES水溶液环境中的纤维素酶样品的CD 峰吸收强度增加并发生红移,说明DES水溶液体系改变了二级结构的相对浓度,从而增强了蛋白质的空间结构。根据CD 光谱,通过CRDATA 和SELCON3 计算α-螺 旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲等二级结构的相对含量,见表2。传统缓冲溶剂中纤维素酶的α-螺旋和β-折叠相对含量分别为26.00%和27.30%,再次证实了天然纤维素酶具有“α+β”型的三级结构特征。DES 水溶液体系提高了α-螺旋和β-转角结构的相对含量,降低了β-折叠和无规则卷曲结构的相对含量。特别是,α-螺旋含量的增加意味着纤维素酶的空间结构具有较高的稳定性。

表2 DES体系下纤维素酶的二级结构含量Table 2 Secondary structure contents of cellulase in DES system

图10 DES体系下纤维素酶的圆二色谱Fig. 10 Circular dichroism of cellulase in DES system

总的来说,DES强大的氢键网络结构可以稳定蛋白质分子构象,并使得纤维素酶的活性氨基酸残基向纤维素酶表面移动,从而使得纤维素酶的活性和稳定性增强。

2.3.2 DES双水相萃取机理研究

紫外光谱可以通过测定蛋白质的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基的紫外吸收峰,进而分析蛋白质三级结构的变化。图11为萃取前后纤维素酶的紫外光谱。从图11可以看出萃取前后纤维素酶的紫外光谱相似,并且其最大吸收峰的位置没有变化。这表明DES与纤维素酶之间没有化学键的形成,即DES双水相体系可以为纤维素酶的萃取提供一个温和的环境,不会改变纤维素酶的构象。

图11 回收前后纤维素酶的紫外光谱Fig. 11 UV spectra of cellulase before and after recovery

荧光光谱可以通过测定蛋白质以及反应体系的荧光强度,从而研究蛋白质在变性或复性过程中整体空间构象的变化。图12为萃取前后纤维素酶的荧光光谱。从图12可以看出,萃取前后的纤维素酶的激发波长位置没有发生改变,进一步证实了DES与纤维素酶之间没有化学键的形成,与紫外光谱分析结果保持一致。

图12 回收前后纤维素酶的荧光光谱Fig. 12 Fluorescence spectra of cellulase before and after recovery

为了进一步研究纤维素酶的萃取机理,本实验利用电导率、动态光散射分析仪考察了DES富集相的微观结构。

不同浓度DES水溶液的电导率测定,见图13。从图13可以看到,根据电导率的变化曲线绘制了两条线性片段,与这两条线性片段的交点对应的浓度为临界聚集浓度(CAC)。DES 的CAC 值为14%(体积分数),在双水相体系中使用的DES浓度均高于此值,因此在DES富集相中均有DES聚集体生成,这也可能是DES双水相体系萃取纤维素酶的主要作用力。

图13 不同浓度DES水溶液的电导率Fig. 13 Conductivity of aqueous solutions of DES with different concentrations

图14为动态光散射分析仪测定的纤维素酶溶液、无酶的DES富集相和含酶的DES富集相中粒子的尺寸分布图。从图14可以看出纤维素酶的粒径在230.1 nm 左右,无酶的DES富集相的粒径在956.3 nm 左右,而含有纤维素酶的DES富集相的粒径在1 233.0 nm 左右,较之以前尺寸明显增大。这证明了在萃取过程中,DES聚集体可能将纤维素酶包裹,形成了新的簇集体。

图14 粒子大小分布图Fig. 14 Size distribution of porticles

萃取机理研究表明:DES的簇集作用是DES双水相体系萃取纤维素酶的主要作用力。在萃取过程中,DES通过簇集作用将纤维素酶包裹,形成新的聚集体,进而将纤维素酶携带进入上相,实现对纤维素酶的回收。并且DES双水相体系为纤维素酶的萃取提供了温和的环境,不会导致酶的结构发生变化。

3 结论

研究了低共熔溶剂体系下纤维素酶的活性,并以此构建双水相体系对纤维素酶进行回收。通过单因素实验确定了最佳萃取条件,并指出DES的簇集作用是双水相体系萃取纤维素酶的主要作用力。纤维素酶的紫外光谱以及荧光光谱证实,双水相体系为纤维素酶提供了一个温和的环境,不会导致酶结构发生变化。电导率和DLS研究表明,纤维素酶的提取可能是因为DES聚集体将其包裹,形成了新的聚集体。本工作首次将DES双水相体系应用于纤维素酶的回收利用,当双水相体系中K2HPO4浓度为0.25 g·m L-1,DES体积分数35%,在25℃下对较少纤维素酶萃取30 min时,达到了94.29%的回收率。此实验可为寻找改善纤维素酶的活性和可回收性的新型绿色溶剂体系提供重要的理论依据。遗憾的是,DES双水相萃取仍不能完全将纤维素酶与糖类分开。但在未来的研究中,将考虑到纤维素酶的构象,并努力设计出具有特定蛋白质鉴定能力的低共熔溶剂。