灵芝参芪茶和葛根枳椇茶斑马鱼生物效应评价

李 英,张贻杨,岳林涛,戴明珠,沈佳琪,郭 杰,李春启

(1.山西振东制药股份有限公司,山西 长治 046000;2.杭州环特生物科技股份有限公司,浙江 杭州 310051)

中国历代医书中均有以茶入药的记载,最早对茶的药用价值记载见首部官修药典《新修本草》。“药茶”概念的形成与流传主要与唐代茶文化和食疗文化的发展有关。目前,药茶已逐渐转变为具有辅助功效的饮品[1-3]。灵芝参芪茶由灵芝、党参、黄芪、黄精和陈皮共五味中药材配伍而成。享有“仙草”美誉的灵芝,味甘、性平,主治虚劳症[4-6],除了补益功效外,现代药理作用还表现为镇静安定、抗衰老和调节免疫等[7-9]。《本草正义》曾论述党参“本与人参不甚相远”,味甘、性平,主治脾胃虚弱、气血两亏、体倦无力,具有增强免疫、抗疲劳、调节糖脂代谢和改善心血管系统功能等药理作用[10-11]。黄精可抗疲劳、抗病原微生物和抗氧化;黄芪补气固表,拔毒排脓,利尿[12]。而陈皮味苦、辛,性温,用于脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多。五味药材按照传统中医药“君臣佐使”理论,适用于抗疲劳和肺虚咳嗽。

葛根枳椇茶由葛根、枳椇子、蒲公英和山药四味中药材组成。葛根含黄酮、葛根素和大豆黄酮等,味甘、辛,性凉,用于表证发热、麻疹不透、热病口渴;枳椇子含有三萜类、黄酮类等,味甘、性平,主治醉酒、烦渴、呕吐和二便不利;蒲公英可利尿、缓泻、利胆;山药改善脾虚泄泻、久痢、虚劳咳嗽。葛根枳椇茶适用于熬夜伤肝、慢性肝病和解酒。目前针对两种药茶生物效应的研究甚少。斑马鱼与人类基因的同源性可以达到87%,具有发育周期短、身体透明和高通量等优点,且在神经、免疫等系统与哺乳动物具有相似的发育机制与特点,其肝脏、肠道的结构和功能与哺乳动物也具有高度的相似性[13-14],利于进行基因编辑等分子操作得到突变体用于机制研究。笔者利用斑马鱼模型快速评价灵芝参芪茶和葛根枳椇茶生物效应,为这两味药茶的机制研究以及实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 斑 马 鱼

转基因巨噬细胞绿色荧光Tg(mpeg1:EGFP)斑马鱼、野生型AB品系斑马鱼、黑色素等位基因突变半透明Albino品系斑马鱼、转基因中性粒细胞绿色荧光Tg(mpx:EGFP)斑马鱼。以上实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2012-0171,实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准号为001458,国际AAALAC认证(001458),均来源于杭州环特生物科技股份有限公司。实验结束后按美国兽医协会(American veterinary medical association,AVMA)条例对斑马鱼实施麻醉安乐死。

1.1.2 试 剂

酒石酸长春瑞滨注射液(批号140501,江苏豪森药业股份有限公司);酒石酸长春瑞滨(批号C10946321,上海麦克林生化科技有限公司);破壁灵芝孢子粉胶囊(金日制药有限公司);无水亚硫酸钠(批号l1428128,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);六水合氯化钴(批号WXBB8070V,Sigma-Aldrich,美国);中华跌打丸(批号191112,广西梧州制药股份有限公司);泼尼松(批号28778,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);三硝基苯磺酸(TNBS,5%水溶液,批号WXBB8070V,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);RU21(批号25747,美国精神科学有限公司)。

1.1.3 仪 器

V3.11行为分析仪(Viewpoint life sciences,法国);电动聚焦连续变倍荧光AZ100显微镜(Nikon,日本);PCO-1500显微注射仪(Zgenebio,中国台湾);体视SZX7显微镜(Olympus,日本)。

1.2 实验方法

1.2.1 药茶前处理方式

灵芝参芪茶和葛根枳椇茶,均为精细炮制后组合型冲泡即饮型药茶包,由山西振东制药股份有限公司提供,阴凉干燥储存。临用前采用料液比m(茶叶)∶m(水)=3∶600,95 ℃水冲泡2次,每次10 min(具体操作:称量3 g药茶于烧杯中,加入300 mL 95 ℃水冲泡10 min后,用0.45 μm滤膜过滤后收集上清备用;继续向烧杯中加300 mL 95 ℃水冲泡10 min过滤后收集上清),合并两次上清液作为5 mg/mL质量浓度母液,现配现用[15]。

1.2.2 增强免疫力(巨噬细胞数量、中性粒细胞数量)评价

将受精后2 d(2 dpf)Tg(mpeg1:EGFP)斑马鱼任意分配于6孔板中,每孔(即每实验组)30尾。分别水溶给予灵芝参芪茶质量浓度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,阳性对照组质量浓度为350 μg/mL的破壁灵芝孢子粉胶囊,同时设置模型对照组、正常对照组,每孔定容3 mL。平行设置两次实验。除正常对照组外,一批实验各组均水溶给予质量浓度400 μg/mL的酒石酸长春瑞滨诱导建立巨噬细胞减少症模型[16-17];另一批各组均静脉注射2 ng每尾(母液质量浓度0.2 mg/mL,每尾10 nL)酒石春瑞滨建立中性粒细胞减少症模型[18]。酒石酸长春瑞滨与灵芝参芪茶共同处理24 h后实验结束:1)根据死亡率确定灵芝参芪茶最大检测质量浓度(The maximum tested concentration,MTC);2)取MTC及3个质量浓度组,分别为阳性对照组、正常对照组和模型对照组,每组任意吸取10尾置于荧光显微镜下拍照、保存图片;3)用高级图像NIS D 3.10处理软件分析并采集每尾斑马鱼尾静脉巨噬细胞荧光强度,用Image J分析并采集斑马鱼尾静脉中性粒细胞数量。

1.2.3 抗疲劳和提高缺氧耐受力作用评价

取4 dpf AB斑马鱼,6孔板/30尾/3 mL体系,分别水溶给予灵芝参芪茶质量浓度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,以质量浓度1 000 μg/mL的中华跌打丸为阳性药,同时设置正常对照组和模型对照组。平行设置两次实验。各组处理24 h后,除正常对照组外,一批实验各组均水溶给予8 mg/mL无水亚硫酸钠1.5 h建立低氧/缺氧疲劳模型[19-20];另一批各组均水溶给与1 mg/mL六水合氯化钴2.5 h建立耐缺氧模型[21],实验结束。根据死亡率确定MTC;取MTC及3个质量浓度组,分别为阳性对照组、正常对照组和模型对照组,每组任意吸取10尾斑马鱼转移至96孔板中,1尾每孔,200 μL每孔,利用行为学分析仪检测每尾斑马鱼1 h总运动距离(无水亚硫酸钠模型S1,六水合氯化钴模型S2)。

1.2.4 酒精性脂肪肝保护作用评价

取5 dpf AL斑马鱼,6孔板/30尾/3 mL体系,分别水溶给予葛根枳椇茶质量浓度78.1,156.3,312.5,625,1 250,2 500,5 000 μg/mL,同时设置模型对照组和正常对照组。除正常对照组外,各组均用1.5%乙醇建立斑马鱼酒精性脂肪肝模型[22]。乙醇与葛根枳椇茶共同处理30 h后实验结束,在实验终点根据死亡率确定MTC。取MTC及3个质量浓度组,分别为正常对照组和模型对照组斑马鱼,立即用4%多聚甲醛固定,经PBS-丙二醇梯度脱水后,利用油红O对肝脏甘油三酯进行染色,染色后每组任意吸取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照,用NIS D 3.10处理软件分析并采集每尾斑马鱼肝脏脂肪染色强度。

1.2.5 解酒作用评价

取5 dpf AB斑马鱼,6孔板/30尾/3 mL体系,分别水溶给予葛根枳椇茶质量浓度625,1 250,2 500 μg/mL,阳性对照组RU21(RU-21安体普天然植物提取物复合片)质量浓度100 μg/mL,同时设置正常对照组和模型对照组。葛根枳椇茶处理24 h后,每组任意吸取12尾斑马鱼转移至96孔板中,1尾每孔,200 μL每孔,除正常对照组外,其余各组均给予1.5%乙醇建立兴奋期醉酒模型[23],立即用行为学分析仪检测每尾斑马鱼1 h内总运动距离。

1.2.6 葛根枳椇茶胃肠道炎症保护作用评价

取3 dpf Tg(mpx:EGFP)斑马鱼,6孔板/30尾/3 mL体系,分别水溶给予葛根枳椇茶质量浓度625,1 250,2 500 μg/mL,用质量浓度15 μg/mL的泼尼松作为阳性对照,同时设置正常对照组和模型对照组。各组处理48 h后,除正常对照组外,其余组别均水溶给予0.125% TBNS建立胃肠道炎症模型[24]。葛根枳椇茶与TBNS继续共同处理48 h后实验结束。在实验终点,每组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照,用NIS-Elements D 3.10软件分析并采集每尾斑马鱼胃肠道中性粒细胞数量。

1.3 统计学分析

用软件GraphPad Prim5.0进行分析和统计,统计结果用mean±SE表示;计量资料用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学处理,以P<0.05作为差异具有显著性的判断标准。

2 实验结果及分析

2.1 增强免疫力评价

2.1.1 确定MTC

在实验终点,当灵芝参芪茶质量浓度为78.1～2 500 μg/mL时,斑马鱼未见明显异常;当质量浓度为5 000 μg/mL时,诱发16.7%(5/30)斑马鱼死亡。提示灵芝参芪茶对免疫低下模型斑马鱼的MTC为2 500 μg/mL。

2.1.2 对巨噬细胞数量、中性粒细胞数量的影响

徐丽华[25]采用小鼠碳粒廓清实验证实,灵芝饮料浓缩液可显著升高免疫功能低下小鼠吞噬指数;任娟等[26]通过大鼠碳粒廓清和小鼠迟发型变态反应也发现,党参黄芪联合提取的多糖具有增强小鼠特异性和非特异性免疫功能、提高大鼠免疫力作用。

斑马鱼尾静脉巨噬细胞荧光强度、中性粒细胞数量如表1所示。由表1可知:模型斑马鱼尾部静脉巨噬细胞荧光强度显著降低,与正常斑马鱼比较P<0.001,提示免疫低下模型构建成功。当阳性对照破壁灵芝孢子粉胶囊质量浓度为350 μg/mL和灵芝参芪茶质量浓度为625,1 250,2 500 μg/mL时,巨噬细胞荧光强度均显著增强,与模型对照组比较均为P<0.001,提示灵芝参芪茶可通过增加巨噬细胞数量从而表现出增强免疫力作用。

表1 斑马鱼尾静脉巨噬细胞荧光强度、中性粒细胞数量(n=10)

斑马鱼尾静脉中性粒细胞数量典型图如图1所示。图1中荧光颗粒为中性粒细胞,虚线框内为分析区域。

图1 斑马鱼尾静脉中性粒细胞数量典型图

由表1和图1可知:模型斑马鱼尾部静脉中性粒细胞数量显著减少,与正常斑马鱼比较比较P<0.001,提示免疫低下模型构建成功。破壁灵芝孢子粉胶囊350 μg/mL和灵芝参芪茶625,1 250,2 500 μg/mL质量浓度组中性粒细胞数量均显著增加,几乎恢复到正常水平,与模型对照组比较均P<0.001。因此,提示灵芝参芪茶可通过增加中性粒细胞数量从而表现出增强免疫力作用。

2.2 抗疲劳和提高缺氧耐受力作用评价

2.2.1 MTC

在实验终点,当灵芝参芪茶质量浓度为78.1～5 000 μg/mL时,斑马鱼均未见明显异常,提示灵芝参芪茶对疲劳模型斑马鱼的MTC为5 000 μg/mL。

2.2.2 抗低氧/缺氧疲劳、提高缺氧耐受力

Xu等[27]、刘晓薇等[28]和Feng等[29]采用小鼠负重游泳、常压缺氧、缺氧瓶急性缺氧实验证实,灵芝茶、灵芝饮料浓缩液具有明显延长负重游泳时间、延长缺氧状态下小鼠生存时间和增加耗氧率作用。实验利用无水亚硫酸钠消耗水中的氧气模拟建立低氧/缺氧环境,从而诱导斑马鱼出现低氧疲劳的运动状态,表现为总运动距离(S1)显著减少。另外利用氯化钴中的钴离子(Co2+)可通过取代氧感受器血红素蛋白卟啉环中的铁离子(Fe2+),使血红素蛋白不能与氧结合的机制,利用从氯化钴建立缺氧耐受模型,模型斑马鱼也表现出总运动距离(S2)显著减少的行为。在这2个模型上,用灵芝参芪茶进行干预,无水亚硫酸钠诱导低氧/缺氧实验每尾斑马鱼总运动距离轨迹如图2所示,其中每个圆圈代表1尾斑马鱼1 h累积运动轨迹。

斑马鱼总运动距离如表2所示。由表2可以看出:灵芝参芪茶不仅可以改善低氧/缺氧疲劳斑马鱼的行为,而且可以提高缺氧耐受力,增加斑马鱼总运动距离。与哺乳动物结果相一致。

表2 斑马鱼总运动距离(n=10)

2.3 对酒精性脂肪肝预防作用评价

2.3.1 MTC

在实验终点,当葛根枳椇茶质量浓度为78.1～2 500 μg/mL时,斑马鱼均未见明显异常;当质量浓度为5 000 μg/mL时,诱发100%(30/30)斑马鱼死亡。提示葛根枳椇茶对酒精性脂肪肝模型斑马鱼的MTC为2 500 μg/mL。

2.3.2 酒精性脂肪肝预防作用评价

葛根解酒护肝作用在国际上已经取得了广泛认可,并有大量哺乳动物实验佐证[30-32]。枳椇子水提物可通过降低乙醇引起的血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST),改善肝脏脂肪变性及炎症而预防酒精性脂肪肝[33-35]。现代中医药研究证明,葛根与枳椇子之间没有配伍禁忌,都属于药食同源类,联合使用具有解酒护肝[23]和清湿热的功效[36]。

斑马鱼肝脏脂肪染色结果典型图以及肝脏脂肪染色强度分别如图3和表3所示。图3中虚线框内为分析区域,即斑马鱼肝脏。由图3和表3可知:模型斑马鱼肝脏甘油三酯经油红O染色后呈现出深红色,而正常斑马鱼肝脏呈无色(或仅背景色),表明酒精诱发斑马鱼脂肪肝模型建立成功。葛根枳椇茶干预后,仅625 μg/mL质量浓度具有明显预防酒精性脂肪肝作用,与模型对照组比较P<0.001。

图3 斑马鱼肝脏脂肪染色强度典型图

表3 斑马鱼肝脏脂肪染色强度(n=10)

2.4 解酒作用评价

RU21经美国药品监督管理局(Food and drug administration,FDA)鉴定和俄罗斯科学院临床试验结果证实,具有减缓乙醇氧化,加速毒性物质分解成乙酸、二氧化碳和水的作用,是公认解酒剂。

葛根枳椇茶处理后,各浓度组斑马鱼总运动距离如表4所示。由表4可知:给予1.5%乙醇后,斑马鱼立刻进入兴奋期醉酒状态,对每尾斑马鱼运动轨迹进行捕捉和分析,可见与正常对照组比较,模型对照组总运动距离显著增加(P<0.001),提示模型建立成功。RU21可显著降低模型斑马鱼总运动距离(P<0.01)。对葛根枳椇茶质量浓度分别为625,1 250,2 500 μg/mL干预后,总运动距离显著降低,逐渐恢复至正常水平,且具有剂量依赖性,提示葛根枳椇茶具有解酒功效。这与哺乳动物结果相一致,有研究表明:葛根异黄酮可通过提高肝脏乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性,清除乙醇及代谢产物[37-39]。

表4 葛根枳椇茶处理后斑马鱼总运动距离(n=12)

2.5 肠道炎症预防作用评价

葛根和枳椇子在抗炎方面临床应用也比较成熟,如葛根提取物通过下调p38/MAPK、NF-κB/p65和上调PPARγ蛋白表达而改善溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠一般状况及黏膜保护作用[34];葛根芩连汤在治疗病毒性肠炎的应用也颇为广泛[40-41]。

斑马鱼胃肠道中性粒细胞数目典型图及统计结果分别如图4和表5所示。图4中:荧光颗粒为中性粒细胞,虚线框内为分析区域。由图4和表5可知:模型斑马鱼肠道中性粒细胞数量明显升高,与正常斑马鱼比较P<0.001,提示肠炎模型构建成功。当阳性对照泼尼松质量浓度为15 μg/mL和葛根枳椇茶质量浓度为625,1 250,2 500 μg/mL时,肠道中性粒细胞数量均明显减少,恢复至正常水平。因此,提示葛根枳椇茶可通过降低中性粒细胞数量从而表现出预防肠道炎症作用。

图4 斑马鱼胃肠道中性粒细胞数目典型图

表5 斑马鱼胃肠道中性粒细胞数目(n=10)

3 结 论

首先,利用可视化的转基因巨噬细胞(Tg(mpeg1:EGFP))、中性粒细胞(Tg(mpx:EGFP))发荧光斑马鱼,结合可量化的统计分析方法,快速、直观和科学地评价了灵芝参芪茶增强免疫力作用;然后,利用行为分析仪对每尾斑马鱼的运动轨迹进行高通量(96孔)追踪,评价了在无水亚硫酸钠、氯化钴两种诱导剂诱导的低氧/缺氧模型下灵芝参芪茶抗疲劳和提高缺氧耐受能力;最后,利用油红O染色法对肝脏甘油三酯进行染色,将肝脏表型结合图片数据采集分析评价葛根枳椇茶对酒精性脂肪肝的预防作用,并评价了葛根枳椇茶对兴奋期醉酒模型斑马鱼行为学的改善作用和对TNBS诱导的胃肠道炎症预防功效。实验结果表明:灵芝参芪茶不仅可通过增加巨噬细胞数量和中性粒细胞数量从而表现出增强免疫力作用,而且可通过改善不同作用机制导致的低氧/缺氧疲劳斑马鱼的行为,增加运动能力,提高缺氧耐受力;葛根枳椇茶不仅可通过降低肝脏甘油三酯含量起到具有酒精性脂肪肝作用,显著降低兴奋期醉酒模型斑马鱼的行为,而且可通过降低中性粒细胞数量从而表现出预防胃肠道炎症功效。研究为灵芝参芪茶和葛根枳椇茶的生物效应及理论研究提供了依据。