长期抑制泛素羧基末端水解酶L1在自发性高血压大鼠视网膜病变中的作用及其机制研究

杜安杰,孙松林,翟俊涛

运城市中心医院/山西医科大学附属运城医院第八临床医学院眼科,山西运城 044000

高血压视网膜病变(HR)是指继发于原发性高血压的视网膜损伤,在高血压患者中的发生率高达70%以上,目前临床尚缺乏特效疗法[1]。泛素-蛋白酶体系统是真核细胞中关键的蛋白降解途径,参与调节细胞增殖、信号转导、炎症等多种生理过程[2]。泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)作为其中主要的去泛素酶,可特异性引起靶蛋白去泛素化以减少其降解,调节蛋白稳态。据报道,UCHL1与高血压和心血管疾病的发生发展密切相关,抑制UCHL1可降低血管紧张素Ⅱ诱导的血压升高和炎症细胞浸润[3],并改善自发性高血压(SHR)大鼠的心脏肥大和功能障碍[4]。提示UCHL1可介导高血压个体靶器官损伤,然而其在HR中的作用仍不清楚。最近研究发现,SHR大鼠成年后即可表现出视网膜毛细血管闭塞及黄斑水肿等高血压视网膜病理损伤[5]。因此,本研究给予SHR大鼠UCHL1抑制剂LDN57444处理,以确定UCHL1在HR中的作用和潜在机制。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级1个月龄京都维斯特(WKY)和SHR雄性大鼠各16只,体重230～280 g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SYXK(京)2021-0010。饲养条件:(23±2)℃恒温环境,12 h光照/黑暗周期,自由饮食。

1.2仪器与试剂 LDN57444(Selleck,美国);苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝,中国);抗UCHL1抗体(Santa Cruz,美国);二氢乙锭(DHE)染色试剂盒(Sigma,美国);抗磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化人核转录因子-κB(p-NF-κB)、磷酸化κB抑制蛋白激酶α/β(p-IKKα/β)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)抗体(CST,美国);抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体(Invitrogen,美国)。

1.3方法

1.3.1实验分组及给药 所有大鼠随机分为WKY对照组、WKY+LDN57444组、SHR对照组和SHR+LDN57444组,每组8只。待2个月龄时给予WKY+LDN57444组、SHR+LDN57444组大鼠灌胃给药LDN57444[20 μg/(kg·d)],WYK、SHR对照组给予等量玉米油,持续4个月。

1.3.2血压测量 各组大鼠自1个月龄起,每周使用无创尾套法(Softron,日本)测量血压和心率,直至6个月龄实验结束。每只大鼠至少测量5次,以平均值作为其最终血压和心率值。

1.3.3视网膜组织结构分析 大鼠眼球标本在4%多聚甲醛固定48 h后,经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,5 μm厚度切片备用。按照HE染色试剂盒说明书步骤进行常规染色。每只大鼠随机选取4个相距至少60 μm的切片,400倍光镜下拍照记录。

1.3.4DHE荧光法检测视网膜氧化应激水平 参考文献[6]方法,取大鼠视网膜组织制备冷冻切片,采用DHE在37 ℃下孵育(5 μm)30 min。BX53荧光显微镜观察并随机选取5张图像拍照记录,用Image J 6.0软件量化荧光强度。

1.3.5同工凝集素(Isolectin B4)/DAPI染色检测视网膜内皮细胞增殖情况 冷冻切片制备方法同上,用Dylight 594标记的Griffonia Simplicifolia Lectin Ⅰ Isolectin B4在4 ℃下透化12 h,并用DAPI室温下孵育5 min。BX53荧光显微镜获取图像,Image J 6.0软件量化荧光强度。

1.3.6实时荧光定量PCR(qPCR)检测 采用qPCR检测视网膜组织UCHL1、炎症因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]和活性氧(ROS)生成相关基因[还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)1、NOX2、NOX4]mRNA水平 麻醉处死大鼠,摘除眼球并分离左眼视网膜,TRIzol一步法提取总RNA。采用ULtraRT one step qPCR Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA,并以其为模板进行PCR扩增,反应体系及条件为:2×ULtraRT one step Buffer 12.5 μL、RNA 1 μg、上下游引物各1 μL、ULtraRT one step EnzymeMix 0.5 μL和无RNA酶的双蒸水补足25 μL。反应程序:45 ℃反转录30 min;预变性95 ℃ 2 min;变性94 ℃ 30 s,退火65 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共40个循环;延伸72 ℃ 5 min。引物序列见表1。

表1 qPCR引物序列

1.3.7蛋白质印迹法(Western blott)检测视网膜组织UCHL1、p-AKT、p-NF-κB、p-IKKα/β、HIF-1α、VEGF蛋白表达 利用组织匀浆器对视网膜组织标本进行匀浆,离心分离后取上清液提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性后,应用十二烷基酸钠-聚丙烯酰胺凝胶对40 μg总蛋白进行电泳,以电湿转的方式将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。置于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h,分别用抗p-AKT(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、p-IKKα/β(1∶1 000)、HIF-1α(1∶500)、VEGF(1∶300)抗体4 ℃孵育过夜,TBST清洗3次后,荧光二抗(1∶10 000)室温孵育1 h。采用ECL化学发光法显示蛋白条带,Image-Pro Plus6.0进行灰度分析。

2 结 果

2.1各组大鼠视网膜UCHL1水平比较 1个月龄时,SHR对照组和WKY对照组大鼠视网膜UCHL1 mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。2、6个月龄时,与WKY对照组比较,SHR对照组大鼠视网膜UCHL1水平明显升高(P<0.05)。见图1。

注:A为Western blot检测WKY对照组和SHR对照组大鼠在1、2、6个月龄时视网膜的UCHL1蛋白水平;B为UCHL1蛋白水平定量统计结果;C为qPCR检测UCHL1的mRNA水平;与WKY对照组大鼠比较,aP<0.05。图1 各组大鼠视网膜UCHL1水平比较

2.2各组大鼠血压比较 与WKY对照组比较,SHR对照组大鼠收缩压从2个月龄开始逐渐升高(P<0.05);与SHR对照组比较,SHR+LDN57444组大鼠收缩压明显降低(P<0.05),但未恢复至WKY对照组大鼠的血压水平。而WKY对照组和WKY+LDN57444组大鼠的收缩压差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注:与WKY对照组比较,aP<0.05;与SHR对照组比较,bP<0.05。图2 各组大鼠血压比较

2.3各组大鼠视网膜形态学比较 HE染色结果显示,两组WKY大鼠视网膜组织完整,结构清晰;SHR对照组大鼠视网膜神经节细胞层排布疏松并出现肿胀,中央视网膜的厚度明显增加,特别是内网状层(IPL)、内核层(INL)和外网状层(OPL);而SHR+LDN57444组大鼠视网膜厚度较SHR对照组明显减少,结构相对规整(P<0.05)。见图3。

注:A为HE染色图;B为视网膜中央厚度统计结果;与WKY对照组比较,aP<0.05;与SHR对照组比较,bP<0.05;GCL为神经节细胞层;ONL为外核层;RPE为视网膜色素上皮。图3 各组大鼠视网膜形态学比较

2.4各组大鼠视网膜氧化应激水平比较 与WKY对照组比较,SHR对照组大鼠视网膜ROS水平升高(P<0.05);与SHR对照组比较,SHR+LDN54777组大鼠视网膜组织ROS水平降低(P<0.05),这些差异主要在INL以上观察到。WKY对照组和WKY+LDN57444组大鼠视网膜ROS水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

注:A为DHE染色图;B为ROS荧光强度量化图;与WKY对照组比较,aP<0.05;与SHR对照组比较,bP<0.05。图4 各组大鼠视网膜氧化应激水平比较

2.5各组大鼠视网膜内皮细胞增殖情况比较 Isolectin B4/DAPI染色结果显示,与WKY对照组比较,SHR对照组大鼠视网膜内皮细胞Isolectin B4荧光强度明显升高(P<0.05);与SHR对照组比较,SHR+LDN57444组大鼠视网膜内皮细胞荧光强度明显降低(P<0.05)。WKY对照组和WKY+LDN57444组大鼠视网膜内皮细胞Isolectin B4荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

注:A为中央视网膜切片Isolectin B4(红色)染色;B为染色定量图;细胞核用DAPI(蓝色)反染;与WKY对照组比较,aP<0.05;与SHR对照组比较,bP<0.05。图5 各组大鼠视网膜内皮细胞增殖情况比较

2.6各组大鼠视网膜IL-1β、IL-6、TNF-α、NOX1、NOX2、NOX4 mRNA水平比较 qPCR结果表明,与WKY对照组比较,SHR对照组大鼠视网膜IL-1β、IL-6、TNF-α、NOX1、NOX2、NOX4 mRNA水平均明显升高(P<0.05)。与SHR对照组比较,SHR+LDN5477组大鼠视网膜中上述各指标水平均明显降低(P<0.05)。WKY对照组和WKY+LDN57444组大鼠视网膜上述各指标水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图6。

注:A为qPCR分析IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA水平;B为qPCR分析NOX1、NOX2、NOX4 mRNA水平;与WKY对照组比较,aP<0.05;与SHR对照组比较,bP<0.05。图6 各组大鼠视网膜IL-1β、IL-6、TNF-α、NOX1、NOX2、NOX4 mRNA水平比较

2.7各组大鼠视网膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF水平比较 Western blot结果显示,与WKY对照组比较,SHR对照组大鼠视网膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白水平明显升高(P<0.05);与SHR对照组比较,SHR+LDN54777组大鼠视网膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白水平降低(P<0.05);WKY对照组和WKY+LDN57444组大鼠视网膜上述指标蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图7。

注:A为Western blot检测6个月龄各组大鼠视网膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF蛋白水平;B为各蛋白定量图;GAPDH用作内参对照;与WKY对照组比较,aP<0.05;与SHR对照组比较,bP<0.05。图7 各组大鼠视网膜p-AKT、p-IKKα/β、p-NF-κB、HIF-1α、VEGF水平比较

3 讨 论

HR是由高血压引起的常见微血管病变并发症,因血压持续升高而造成视网膜病理重塑,导致视网膜水肿、出血、缺血或渗出等病变[7]。HR不仅能反映心脏、大脑、肾脏等全身血管和器官的病理程度,也是导致视力下降甚至失明的主要原因[8]。因此,迫切需要深入了解HR的发病机制,探索抑制HR进展的新型分子靶点,以改善高血压患者预后。

泛素-蛋白酶体系统在高血压相关疾病中发挥关键作用[9]。作为主要的去泛素化酶之一,UCHL1具有多种生物学功能,并与神经退行性疾病、癌症、心血管疾病和视网膜病变有关[10]。研究发现,UCHL1在压力负荷过载和血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠心肌细胞中水平升高,并与心肌损伤程度呈正相关[11],但在糖尿病大鼠的视网膜中表达减少[12]。然而,UCHL1在HR中的研究报道较少。LDN54777是一种可逆的竞争性UCHL1水解酶活性抑制剂,其选择性阻断UCHL1活性已被证实可延缓阿尔茨海默病的进展,抑制癌症侵袭,并改善心脏肥大和功能障碍[13]。最新研究发现,SHR大鼠在2个月龄时开始表现出轻度高血压,但对靶器官没有明显损伤;随着血压持续升高,在6个月龄即可显示出高血压视网膜的病理损伤[5]。因此,本研究选用SHR大鼠作为HR的动物模型,以探究UCHL1对HR的作用及潜在的分子机制。本研究结果显示,SHR大鼠从2个月龄开始,视网膜中UCHL1的mRNA和蛋白水平升高。此外,SHR大鼠的收缩压、中央视网膜厚度、炎症和超氧化物产生均较WKY大鼠升高,其机制与UCHL1水平有关。相比之下,每日给予2、6个月龄SHR大鼠LDN54777治疗明显减弱了这些影响。以上结果表明,UCHL1可作为HR严重程度的标志物,其水平升高是HR发病机制中的一个重要因素,抑制UCHL1的表达可以防止HR的发展,UCHL1是治疗HR的潜在治疗靶点。

虽然血压升高是HR的主要原因,但它不能完全解释其发病机制。HR的其他重要机制包括氧化应激、慢性炎症、内皮功能障碍和高血压/血管紧张素Ⅱ诱导的血管重塑等[14]。研究发现,IL-1β水平升高可引发脉络膜退化,导致外层视网膜严重缺氧[15]。此外,IL-1β、IL-6、TNF-α在免疫激活和炎症反应中共同发挥调节作用,参与血管紧张素Ⅱ诱导的视网膜中NOX和VEGF的激活,间接刺激视网膜血管新生,增加视网膜内皮细胞的通透性[16]。ROS是生物系统中普遍存在的信号分子,在促进炎症、内皮细胞增殖和迁移及新生血管的形成方面发挥关键作用[17]。NOX酶家族(NOX1、NOX2和NOX4)作为视网膜血管内皮细胞中ROS的主要来源,可引起内皮细胞功能紊乱,从而导致视网膜形态学变化和功能障碍。本研究结果显示,6个月龄SHR大鼠视网膜中促炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和NOX1、NOX2、NOX4水平较WKY大鼠均升高,并提高了视网膜内皮细胞增殖能力,这与以往的研究结果一致[18]。此外,本研究发现,与SHR对照组比较,接受LDN54777处理的SHR大鼠视网膜中上述指标水平明显降低。这些结果表明,高血压引起的炎症激活和超氧化物的产生在HR的发展过程中发挥重要作用,抑制UCHL1的表达不仅能明显降低血压,还能改善炎症和超氧化物的增加。

多种信号通路在HR中被激活,包括AKT、同源性磷酸酶、NOX、转化生长因子β1/Smad和NF-κB[1]。研究发现,UCHL1调节与炎症、氧化应激和动脉血管重塑有关的多种蛋白质的降解,包括p53、人NF-κB抑制蛋白α和HIF-1α[19-20]。通过进一步探索UCHL1的作用机制发现,与WKY大鼠比较,SHR大鼠视网膜中p-AKT和HIF-1α水平升高。这种变化在LDN54777治疗的SHR大鼠中被逆转,并降低了高血压视网膜的病理损伤。为了确定LDN54777如何抑制SHR大鼠的HR,本研究进一步分析了多种信号传导途径。结果表明,LDN54777明显阻断了AKT、HIF-1α和相关信号介质(IKKα/β、NF-κB和VEGF)的激活。作为高血压中炎症反应的一个重要上游信号成分,NF-κB的激活引发了参与早期免疫反应每个阶段的各种炎症细胞因子的表达和分泌[21]。相关研究表明,NF-κB信号传导是VEGF、IL-6和NOX的主要调节因子,进而调节氧化应激和血管功能,导致炎症因子渗入靶器官,激活炎症[22]。提示LDN54777对HR的保护作用可能与抑制AKT、IKKα/β、NF-κB、HIF-1α和VEGF信号通路有关。

综上所述,UCHL1水平升高是HR发病机制的重要决定因素,抑制UCHL1的机制可能是通过抑制AKT、HIF-1α和下游相关信号介质(IKKα/β、NF-κB和VEGF)的激活实现的,抑制UCHL1可降低血压,改善视网膜中央厚度、抑制炎症和氧化应激水平,防止HR进展,UCHL1可能是HR的一个有前途的治疗靶点。