西藏巨柏种子萌发过程中生理指标的响应

常馨月, 万路生, 杨小林, 蒋 腾, 杨雯静, 刘 峰, 赵垦田

(1.西藏大学理学院, 拉萨 850000; 2.重庆三峡学院生物与食品工程学院, 重庆 万州 404000;3.西藏农牧学院资源与环境学院, 西藏 林芝 860000;4.华能西藏雅鲁藏布江水电开发投资有限公司, 西藏 林芝 860000;5.中国电建集团成都勘测设计研究院有限公司, 成都 610000;6.华能西藏水电安全工程技术研究中心, 西藏 林芝 860000)

巨柏(Cupressusgigantea)系柏科(Cupressaceae)柏木属(Cupressus)高大乔木[1],为我国西藏特有物种,主要散生分布在雅鲁藏布江及其支流沿岸的林芝市巴宜区、米林县和朗县等地,或在海拔3 000～3 400 m的阳坡形成疏林。因种群数量稀少和天然更新困难等原因,巨柏被确定为国家一级保护物种,并在2004年列入中国物种红色名录[2]。

目前,巨柏的研究主要集中在苗木培育、群落生态学和种子繁育等方面[3-9],且研究发现巨柏群落存在天然更新困难等问题。通过对巨柏种子萌发过程中的生理指标进行研究分析,明确巨柏种子萌发的生理变化规律,以期更深层次地了解巨柏种子繁育机制,促进巨柏种质资源保护,进而为巨柏的天然更新和种群扩大提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

巨柏采种林分位于西藏自治区林芝市朗县洞嘎镇扎西塘村,地理坐标为28°59′49″N,93°18′0″E,海拔3 060 m。研究地为高山峡谷地带,具有干热河谷气候特征,年降水量在400 mm左右,降水主要集中在4—9月,且以6、7月最高,是温带半湿润至半干旱的过渡区。

于2020年8月在雅鲁藏布江右岸的阶地巨柏林进行采种,分别采集3棵巨柏母树树冠下部不同方位的球果混合备用,自然风干取种,5 ℃贮藏。种子千粒重为4.137 g,含水量为7.59%。

1.2 方 法

2020年11月,将供试种子用0.5%的高锰酸钾溶液进行消毒后用20 ℃蒸馏水浸种2 d[8],采用沙培法[9]进行发芽试验。在巨柏种子萌发过程中,自浸种开始每2 d进行一次取样,观察种子形态特征,并测定各时期的主要生理生化指标,包括含水量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、过氧化氢酶(CAT)活性和过氧化物酶(POD)活性。

采用考马斯亮蓝G-250染色法和蒽酮-H2SO4比色法分别测定种子的可溶性蛋白含量和可溶性糖含量。采用紫外吸收(Tris-HCl)法和愈创木酚法分别测定CAT活性和POD活性[10]。

1.3 数据统计分析

用Excel 2003软件和Origin 9.0软件进行数据统计、数据处理和图表制作,用R软件和SPSS 25.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 巨柏种子萌发过程中形态特征的变化

通过观察发现,巨柏种子萌发过程的第1～2天为巨柏种子吸胀时期;第4天巨柏种子种壳破裂露白;第6天胚根长度达到2 mm,约为巨柏种子长度的一半,开始记录种子萌发;第8天胚根长度达到1 cm,巨柏种子萌发达到高峰时期,可测定其种子发芽势;第12天胚根长度为2～2.5 cm,可观察到子叶生长,并有极少数种子的种皮脱落、子叶开始展开;第16天胚根长度为2.5～3.0 cm,子叶完全展开,萌发基本结束。

根据巨柏种子的萌发特征将巨柏种子的萌发过程划分为7个阶段:第一阶段为未处理时期;第二阶段为吸水膨胀的时期;第三阶段为种壳破裂,出现露白的时期;第四阶段为胚根长度达到2 mm的时期;第五阶段为胚根长度达到1 cm的时期;第六阶段为出现子叶的时期;第七阶段为子叶展开的时期。

2.2 巨柏种子萌发过程中含水量的变化

巨柏种子萌发过程中含水量呈增长趋势,不同时期的含水量存在显著差异。由表1、图2可知,巨柏种子的含水量在浸种前最低,吸胀期间含水量显著升高,日增长速率达到12.97%,种子含水量由7.59%变为33.53%;而后日增长速率降低,为2.045%,含水量缓慢增长,巨柏种子的含水量在种壳破裂和种子开始萌动时分别为36.82%和45.80%;胚根开始生长后,含水量再一次显著升高,日增长速率约为4.12%,当子叶完全展开时,巨柏种子的含水量可达78.77%。

图1 巨柏种子萌发过程的形态特征

图2 巨柏种子萌发过程中含水量的变化

表1 巨柏种子萌发过程中生理指标的差异性分析

2.3 巨柏种子萌发过程中可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化

巨柏种子萌发过程中可溶性蛋白的含量呈先降后升的变化趋势,可溶性糖的含量呈先升后降再升的变化趋势,见图3。不同时期的可溶性蛋白和可溶性糖含量均存在显著性差异,见表1。

图3 巨柏种子萌发过程中可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化

巨柏种子中可溶性蛋白的含量在种子吸胀时期几乎没有变化;随着种子种壳破裂、出现露白,巨柏种子中可溶性蛋白的含量发生显著变化,由292.62 mg/g降低为102.10 mg/g;在胚根生长时期,巨柏种子中可溶性蛋白含量的降低速率减慢,但仍出现显著性变化,并在第8天达到整个萌发时期的最低含量(80.00 mg/g);而后随着子叶的出现和生长,可溶性蛋白含量显著升高。

巨柏种子中可溶性糖含量在种子吸胀时期显著升高;成熟的巨柏种子中可溶性糖含量较高,为28.10 mg/g。第4天种壳破裂、出现露白时,巨柏种子可溶性糖含量达到最高,为41.08 mg/g;而后胚根开始生长,可溶性糖含量逐渐降低,在第12天能观察到子叶生长时达到最低值,为1.07 mg/g;之后随着子叶的生长,可溶性糖含量迅速显著升高。

2.4 巨柏种子萌发过程中CAT和POD活性的变化

巨柏种子萌发过程中CAT和POD活性均呈先升后降的变化趋势,且均存在显著性差异。

由表1、图4可知,巨柏种子的CAT活性在种壳破裂、出现露白之前没有明显变化,CAT活性显著较低,约为0.79～2.70 U/g;随着种壳破裂,种子开始萌发,CAT活性显著升高,第8天达到巨柏种子萌发过程的最高值(134.63 U/g);子叶出现后,CAT活性略有降低但不存在显著性变化,而后随着子叶的生长,CAT活性开始显著下降。

图4 巨柏种子萌发过程中CAT和POD活性的变化

巨柏种子的POD活性在子叶出现之前随着种子的萌发逐渐升高,吸胀期间升高速率最快,可达22.71 μg/(g·d),POD活性升高为68.97 μg/g;之后速率降低,在第8天种子萌发达到高峰时,巨柏种子的POD活性达到整个萌发过程的最高值(108.62 μg/g);而后随着胚根和子叶的生长,POD活性显著下降。

2.5 巨柏种子萌发过程中生理指标的相关性分析

由表2可知,在巨柏种子萌发过程中,萌发时间与含水量、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和CAT活性均存在显著相关性,其中萌发时间与含水量和CAT活性存在极显著正相关,相关系数为0.943和0.608;与可溶性蛋白含量存在极显著负相关,相关系数为-0.713;与可溶性糖含量存在显著负相关,相关系数为-0.470。含水量与可溶性蛋白含量和CAT活性存在显著相关性,其中含水量与CAT活性存在显著正相关,相关系数为0.543;与可溶性蛋白含量存在极显著负相关,相关系数为-0.595。可溶性蛋白含量与可溶性糖含量和CAT活性存在显著相关性,其中可溶性蛋白含量与可溶性糖含量存在显著正相关,相关系数为0.477;与CAT活性存在极显著负相关,相关系数为-0.694。可溶性糖含量与CAT活性存在极显著负相关,相关系数为-0.854。

表2 巨柏种子萌发过程中生理指标的相关性分析

3 讨 论

本研究中可溶性蛋白含量呈先降后升的变化趋势,与露水草和川续断种子萌发过程中蛋白质含量的变化规律相同[11-12]。蛋白质是种子中重要的营养物质。成熟的巨柏种子中可溶性蛋白的含量较高,当其开始萌发后,种子内贮藏的蛋白质在酶的作用下被不断分解成氨基酸并输送至胚根,为种子萌发提供营养,可溶性蛋白含量迅速下降[13]。而后随着子叶的生长,巨柏种子的可溶性蛋白含量升高,这可能是萌发的巨柏种子进入新的代谢模式,合成大量新的蛋白质。

可溶性糖含量的变化代表植物体内碳水化合物的代谢过程,反映了种子内部复杂的生理生化反应规律。本研究中,可溶性糖含量呈先升高后降低再升高的变化趋势,与青蒿和掌叶木种子萌发过程中可溶性糖含量的变化规律相同[14-15]。种子萌发过程中的代谢活动自种子吸胀开始,巨柏种子萌发初期,种子吸胀并于内部进行物质代谢,可溶性糖含量逐渐升高,为种子进一步萌发积蓄能量;胚根突破种皮的阶段是种子萌发过程中物质代谢最活跃的时期,随着种壳破裂、出现露白,可溶性糖含量急剧下降,这可能是种子萌发过程需要大量的营养物质和能量,使得种子内贮藏的可溶性糖被大量分解、消耗[16];之后随着子叶的生长,萌发后的巨柏种子生理机能逐渐完善,叶片开始进行光合作用并合成大量可溶性糖,巨柏种子的可溶性糖含量升高。

CAT和POD是植物组织内广泛存在的两种酶,两者可以协同反映种子萌发的活力大小和细胞的生长分化状况[17],进而反映植物的抗衰老能力。多数研究认为,种子内POD的活性随着种胚的生长逐渐升高,且提高种子内POD活性,可有效促进种子萌发[18]。成熟的巨柏种子中CAT和POD活性较低,种子抗衰老能力较强,极耐储存。巨柏种子萌发过程中CAT和POD活性呈先升后降的变化趋势,与浦梅[19]对滇重楼种子的研究结果一致。在巨柏种子萌发初期,种子萌发活力较大,细胞快速分化,CAT活性和POD活性升高,这与巨柏种子萌发过程中表现出的特征一致;而后随着胚根和子叶的生长,种子萌发活力减弱,细胞分化速率减慢,CAT活性和POD活性降低。巨柏种子萌发过程中POD活性的变化规律可能与以种子为主的代谢方式转变为以叶片为主的代谢方式有关。

4 结 论

巨柏种子萌发过程划分为7个阶段。巨柏种子萌发过程中含水量呈增长趋势,可溶性蛋白含量呈先降后升的变化趋势,可溶性糖的含量呈先升后降再升的变化趋势,CAT活性和POD活性均呈先升后降的变化趋势。

萌发时间与含水量和CAT活性存在极显著正相关,与可溶性蛋白含量存在极显著负相关,与可溶性糖含量存在显著负相关;含水量与CAT活性存在显著正相关,与可溶性蛋白含量存在极显著负相关;可溶性蛋白含量与可溶性糖含量存在显著正相关,与CAT活性存在极显著负相关;可溶性糖含量与CAT活性存在极显著负相关。