刺山柑种子休眠及萌发特性研究

王云兴, 吾买尔夏提·塔汉

(新疆农业大学生命科学学院, 乌鲁木齐 830000)

刺山柑(CapparisspinosaL.)为山柑科山柑属多年生藤本蔓生落叶小半灌木,又称野西瓜、抗旱草等[1]。广泛分布于西班牙、意大利、土耳其和伊朗等国,我国新疆、西藏和甘肃也有分布,常见于石质低山、砾石荒漠、盐碱地和戈壁滩等[1-2]。刺山柑叶、果、根皮均可入药,有祛风除湿、止痛、消肿等功效,可治疗关节炎、风湿病等;其花蕾作为一种调味品深受欧洲人喜爱[3-4]。刺山柑是一种多用途植物,具有耐旱、耐高温、耐贫瘠和耐盐碱等多种优良特性,是荒漠生态恢复与植被重建的优选物种[2]。近年来,刺山柑作为固沙植物具有极高的观赏价值,广泛栽培于旱生植物园[2,5]。

刺山柑可通过种子繁殖或茎段扦插繁殖,然而,刺山柑在自然条件下存在萌发率低与生根困难等问题,使其在许多地区繁殖栽培困难,限制了该作物的推广[3,6-15]。过度放牧和过度收割导致刺山柑资源极度匮乏,甚至还产生了极其严重的荒漠生态危机[16-17]。刺山柑种子萌发率低,可能存在休眠,但不同的学者持有不同的观点[18]。研究表明,可能导致刺山柑种子低萌发的休眠类型分别为物理休眠、生理休眠和组合休眠[3,5,11-12,14,16-17,19]。本研究根据Baskin[20]提出的休眠分类系统,在一定的光照和温度条件下通过低温层积、GA浸泡、干藏和埋藏等方法,探讨刺山柑种子的休眠类型和种子萌发特性。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为刺山柑的成熟种子,2021 年 9 月分两批采集于新疆哈密二堡镇(93°01′47″E,42°58′19″N)戈壁滩的自然群落,种子在清水中浸泡从果肉中分离出来,室温阴干后保存于干燥通风处备用。

1.2 方 法

1.2.1种子的形态指标和千粒重测定

在体式显微镜下观测种子的颜色、形状及大小,重复20次。随机选取成熟、发育正常的果实,用游标卡尺分别测量20粒种子的长度。采用四分法取一定量种子(大于4 000粒),将种子分为4份,每份随机数1 000粒称重,4次结果加权平均,即得种子千粒重。

1.2.2吸水试验

为了确定刺山柑种子的吸水情况,2022年3月31日,在实验室将刺山柑种子分别放入5个垫有双层湿滤纸的培养皿中,每皿50粒。先用Sartorius BS 124 S型(0.000 1 g)电子天平称量刺山柑种子的原始重量,从未吸水(干种子)起,每隔30 min取出(随种子的吸水速率而适当调整称重时间),用滤纸吸干种子表面的水分后,在电子天平上称重,直到种子质量不再增加为止,绘制吸水曲线,分析种子的吸水动态变化。

吸水率/%=[(湿重-干重)/干重]×100%。

1.2.3萌发特性研究

将种子置于1%的次氯酸钠溶液中消毒10 min,然后用自来水冲洗3遍,蒸馏水冲洗1遍,每处理均为25粒种子,4次重复,共100粒。种子均匀摆放于垫有2层滤纸,直径为90 mm的培养皿中,持续培养28 d。实验的光照条件设置为每天12 h光照[100 μmol/(m2·s),400～700 nm,白炽灯光]和全黑暗,黑暗处理是将培养皿包裹于锡纸中。

胚根突破种皮视为萌发。在光照条件下培养的种子每24 h统计一次萌发数,并将萌发的种子取出,每天加适量蒸馏水以保持湿度一致;全黑暗处理的种子要保持完全避光,萌发率在绿光灯下每7 d检测一次。实验结束后未萌发的种子用2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)检测种子活力。

1) 室内干藏(后熟)

将刚收获的种子于室温下干藏,分别检测贮藏0(刚采收),3,6,9,12个月种子的萌发率。培养皿置于15 ℃/2 ℃、20 ℃/10 ℃、25 ℃/15 ℃及30 ℃/15 ℃等温变周期(12 h光照/12 h黑暗或全黑暗)条件下培养28 d。不同的温度反映野外生境中一年四季的温度变化,即5 ℃/2 ℃(11月),15 ℃/2 ℃(3—4月),20 ℃/10 ℃(5月、9—10月),30 ℃/15 ℃(6—8月);冬季生境中的温度低于0 ℃,种子在该温度下不会萌发。

2) 野外埋藏

本研究的目的是确定在野外打破休眠的时间以及埋藏的种子是否经过休眠周期。2021年10月25日,将干藏1个月的种子装入珍珠纱网袋中,共10袋。将网袋分别埋入盛满土壤的塑料盆(深为15 cm,直径为20 cm)的2 cm深处,然后将盆埋在新疆农业大学实验地中,使种子经历野外自然温度和土壤水分条件的变化。

2021年11月25日—2022年6月,每月定期从试验地取回一个花盆于最适萌发温度(15 ℃/2 ℃)和光照(12 h光照/12 h黑暗或全黑暗)条件下对种子进行28 d的萌发试验(2021年12月至翌年2月,积雪覆盖除外)。

3) 冷层积

将刚收获的种子置于直径为120 mm装有湿河沙的玻璃培养皿中,用锡纸包裹后置于4 ℃恒温冰箱中层积0,4,6,8周。层积处理后,将种子置于最适萌发温度(15 ℃/2 ℃)和光照(12 h光照/12 h黑暗或全黑暗)条件下连续培养28 d。

4) 赤霉素对种子萌发的影响

将干藏的种子定时(时间随干藏处理而定)分别取回,置于不同浓度(0,100,300,500,700 mol/L)的赤霉素溶液中浸泡24 h后,在最适萌发温度(15 ℃/2 ℃)和光照(12 h光照/12 h黑暗或全黑暗)条件下培养28 d。

1.2.4数据处理

采用SPSS 26软件对所得数据在95%水平上通过二因素方差分析(Two-way ANOVA)或三因素方差分析(Three-way ANOVA)检验差异的显著性,萌发结果以百分率±标准误表示,图表采用GraphDad Prism 9软件绘制。

2 结果与分析

2.1 种子的形态指标和千粒重测定

刺山柑种子肾形,成熟种子为深棕色或黑褐色,长(2.4±0.2)mm,宽(1.7±0.2)mm,厚(1.4±0.2)mm,千粒重(3.931 6±0.096 2)g(图1),种子小且种皮厚。

图1 刺山柑果实(A)、成熟果实(B)、种子(C～D)

2.2 种子的吸水实验

完整的刺山柑种子吸水速度较慢,在水中浸泡12 h其重量仅增加(24.48±1.44)%,种子的吸水于第4天才开始稳定,增重(37.5±1.77)%,达到饱和状态(图2)。表明刺山柑种子吸水较慢且吸水较少。

图2 刺山柑种子的吸水曲线

2.3 干藏对刺山柑种子萌发的影响

三因素方差分析结果(表1)表明,光照、干藏时间、光照与温度的交互作用及其光照、温度与干藏时间的交互作用对种子萌发无显著性影响,其他因素对种子萌发均有显著性影响。活力检测后发现,98%未萌发种子是有活力的。

表1 室内干藏条件下,光照、温度、干藏时间及其交互作用对刺山柑种子萌发影响的三因素方差分析

预实验结果表明,刺山柑种子在5 ℃/2 ℃条件下不萌发,故该温度在干藏实验中去除。15 ℃/2 ℃为种子的最佳萌发温度,除干藏试验外,其他萌发试验均于该温度下进行。

新收获的种子在各温度和光照条件下不萌发或有较低的萌发率,刚收获的成熟种子在15 ℃/2 ℃温度下具有较高且稳定的萌发率。种子的萌发率并没有随着室内干藏时间的延长而发生显著性变化(图3),最大萌发率出现在干藏的第3个月,在15/2 ℃的光照和全黑暗条件下分别达(52.00±11.31)%和(55.00±18.29)%。说明干藏处理不能解除刺山柑种子的休眠。

注:不同小写字母表示相同储藏时间在不同温变梯度下萌发率存在差异显著(p<0.05)。

2.4 野外埋藏对刺山柑种子萌发的影响

二因素方差分析结果(表2)表明,光照、光照与埋藏时间的交互作用对种子的萌发率没有显著影响,埋藏时间对种子的萌发率有显著影响。

表2 光照和埋藏时间及其交互作用对刺山柑种子萌发影响的二因素方差分析

野外自然温度下,随着埋藏时间的延长,种子的萌发率逐渐提高(图4)。埋藏的第6个月,种子的萌发率在各光照条件下分别达到(90.00±1.15)%和(93.00±6.83)%,说明埋藏能解除种子休眠。

图4 刺山柑种子野外埋藏0,1,5,6个月在光照和黑暗及15 ℃/2 ℃温变梯度下的最终萌发率

2.5 冷层积对刺山柑种子萌发的影响

二因素方差分析结果(表3)表明,光照、冷层积时间、光照与冷层积时间的交互作用对种子萌发率均有显著影响。

表3 光照和冷层积时间及其交互作用对刺山柑种子萌发影响的二因素方差分析

在4 ℃恒温冰箱进行冷层积处理后,种子萌发率随层积时间的延长而显著提高(图5),在黑暗条件下的萌发率比光照条件下的稍高,说明低温层积能快速解除种子休眠。

图5 刺山柑种子冷层积0,4,6,8周在光照和黑暗及15 ℃/2 ℃温变梯度下的最终萌发率

2.6 赤霉素对刺山柑种子萌发的影响

三因素方差分析结果(表4)表明,光照和干藏时间的交互作用、光照与干藏时间和赤霉素浓度的交互作用对种子萌发率无显著影响。光照、干藏时间、赤霉素浓度、光照与干藏时间的交互作用、干藏时间与赤霉素浓度的交互作用对种子萌发率有显著影响。

表4 室内干藏条件下,光照、干藏时间、赤霉素及其交互作用对刺山柑种子萌发影响的三因素方差分析

室内干藏的种子经不同浓度赤霉素浸泡24 h后,在黑暗环境中有较高的萌发率,萌发率随干藏时间的增加呈先增加后减少的趋势(图6)。除第6个月外,其余处理的萌发率在赤霉素浓度为300 mg/L时相对较高且稳定,第9个月萌发率在光照和黑暗条件下均最大,分别为(55.00±3.416)%和(65.00±3.41)%。结果表明,赤霉素处理能明显提高种子萌发率,300 mg/L 赤霉素+黑暗条件为该处理下的最佳萌发方案。

注:图中不同小写字母表示相同储藏时间在不同赤霉素浓度梯度下萌发率存在显著差异(p<0.05)。

3 讨 论

休眠是指整个植物或植物器官以生长和发育的暂时停止为特征的一种状态[21]。目前国际上认可的种子休眠类型有五类,分别是物理休眠(PY)、形态休眠(MD)、生理休眠(PD)、生理形态休眠(MPD)和组合休眠(PY+PD)[20]。刺山柑种子因种皮特性引起休眠的报道较多[3,5,10,12,16,22],但本研究结果表明,刺山柑的种子具有一定的吸水能力,这与Foschi等[11]的研究结果一致,表明水分不是限制刺山柑萌发的主要因素,即刺山柑种子不存在物理休眠。刺山柑种子不易吸水有两种原因:一是刺山柑种子的种皮木质化,只能从种脐吸水;二是种子内脂肪含量高达30%[19,23]。另外,在一年的干藏实验中,刺山柑种子的萌发率在各温变周期均无显著提高,说明种子不存在后熟现象,即刺山柑种子不存在形态休眠。综上所述,刺山柑种子存在生理休眠。生理休眠又分为深度生理、中度生理和非深度生理休眠[24],本研究中,通过赤霉素处理和低温层积8周均可显著提高刺山柑种子萌发率,说明刺山柑属于非深度生理休眠。

温度对种子有重要的生理作用。温度不仅可以改变种子的休眠状态,即低温或高温层积可解除种子的休眠状态。轮叶碎米荠(Cardamineconcatenata)种子在5 ℃冷层积28周后萌发率达到98%;在30 ℃/15 ℃温度条件下进行4周暖层积预处理后于5 ℃下冷层积(持续50周),萌发率可达100%[25]。本研究结果表明,低温层积可显著提高刺山柑种子的萌发率,仅层积8周便可解除休眠,萌发率达90%。此外,温度还会影响无休眠种子的萌发速率,种子在萌发过程中代谢反应活跃,在一定的温度范围内,种子的萌发进程随温度的升高而加快。大多数种子在变温条件下的萌发率较恒温条件下高。变温可加快酶的催化作用,促进贮藏物质的转化,其次变温利于种壳软化,利于种胚突破种皮,促进萌发。Hypericumericoides在12 ℃/20 ℃变温条件下萌发率几乎达100%。变温还有助于幼苗建成,如沙芥和斧翅沙芥种子在黑暗和20 ℃/30 ℃变温条件下有利于种子萌发和幼苗建成[26]。李欣勇等[27]对风车草种子的萌发特性研究发现,恒温和变温条件下的萌发率有显著差异,恒温下的萌发率显著低于变温。不同物种的种子最适萌发温度有差异,种子萌发的最适温度与植物各自的生境有密切关系。本研究结果表明,刺山柑种子经4 ℃低温冷层积处理后,萌发率迅速提高,且15 ℃/2 ℃的温变周期为刺山柑种子最适萌发温度。

在荒漠或半荒漠地区,不同植物种子的萌发对光照有不同的要求。雀麦属(Bromus)植物种子在萌发时并不需要光照[28],而油蒿的瘦果在光照条件下萌发,在暗条件下萌发受到抑制[29]。许多荒漠植物的种子在光照和黑暗条件下萌发都很好,部分在暗中的萌发较在光下好,如梭梭种子[30]。本研究结果表明,干藏、埋藏处理的种子萌发率在光照和黑暗条件下均无显著性差异,层积和赤霉素处理的种子在黑暗条件下萌发较光照下好,说明刺山柑种子的萌发对光照没有严格要求,在黑暗条件下较光下稍好。这与马生军等[31]对刺山柑发芽条件研究的结果一致。

刺山柑作为一种落叶小灌木,在自然生境中,5月始花,6—9月生产果实,果熟期为1个月,10月植株的地上部分死亡。因此,在2021年9月采集当年的种子进行实验,采集过程中并未发现掉落的种子有出苗现象,于当年10月将刺山柑种子埋藏于试验地中,经6个月野外埋藏的刺山柑种子全在网袋中萌发。埋藏通过调节土壤湿度和温度调节种子萌发,冬季野外生境温度低于0 ℃,大雪消融后取回埋藏的刺山柑种子进行萌发实验,发现其萌发率得到显著提高,并在4月达到90%以上。综上,该处理等同于低温层积处理打破种子休眠,这与Gulizebo等[8]的研究结果一致。

赤霉素(GA)是一种调控植物许多关键生理过程(如种子萌发、根和茎的伸长、开花、坐果和种子发育)的重要激素。GA能取代一些种子对低温后熟的需求,通常可解除种子的浅度生理休眠。外源添加赤霉素可直接提高其种子内部赤霉素含量,促进种子萌发。休眠的石生茶藨(Ribessaxatile)种子经低温层积30 d后使用300 mg/L的GA3溶液处理2 h,萌芽率可高达82.67%[32]。然而,GA对解除生理休眠的作用因种而异。GA处理对美国梧桐(Acerpseudoplantanus)种子的萌发率没有显著提高,而细胞分裂素能够提高45%[33]。本研究结果表明,GA3处理能显著提高刺山柑种子萌发率,300 mg/L的GA处理下,刺山柑种子萌发率较高且稳定,这与Bahrani等[7]的研究结果一致。

4 结 论

1) 刺山柑种子存在非深度生理休眠;

2) 种皮具透水性;

3) 最适萌发温度为15 ℃/2 ℃;

4) 光照不是刺山柑种子萌发的必要条件;

5) 可通过低温层积打破休眠,赤霉素能显著提高其萌发率。