叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法学验证试验设计

张莉华，吕红萍，陈少军，王胜南，刘爱琴，许新德,

1. 浙江药科职业大学（宁波 315100）；2. 浙江可明生物医药有限公司（新昌 312500）；3. 浙江医药股份有限公司新昌制药厂（新昌 312500）

高职本科教学旨在培养高层次技术技能型人才，更加注重实践和应用能力的培养，而试验教学是人才培养的重要组成部分，是培养学生实践应用能力的重要手段[1-2]。试验教学不仅能加深对专业知识的理解，更重要的是培养学生运用所学知识和方法解决实际工作问题的能力，如试验设计、数据分析和计算，以及通过合理有效的综合分析得出正确的结论等。

具体到高职本科食品营养与健康专业的功能性食品开发与评估试验课程，设计具有专业特色的功效成分含量测定方法学验证综合试验——叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法学验证试验设计。叶黄素是一种含氧类胡萝卜素，广泛存在于自然界中，而商品化的叶黄素主要从万寿菊花中提取分离制得[3-4]。叶黄素具有营养和着色的双重功能[4]，在缓解视疲劳[5-8]、抗氧化[9-10]功能食品中被广泛应用。叶黄素功能性软糖[3,6]、乳饮料[5]、软胶囊[7,9]、颗粒[8,10]、片剂[11-12]制备及评价研究较多，但关于功效成分含量测定的方法学验证试验设计鲜有报道。

结合专业课程建设整体安排，设计叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法学验证综合试验，进行专属性、线性、精密度、准确度、稳定性等的方法学考察，探讨紫外-可见分光光度法测定叶黄素咀嚼片中叶黄素含量的可行性，为叶黄素咀嚼片质量控制和功效成分含量的测定奠定基础。通过方法学验证过程中的验证方案设计、验证试验操作及对试验结果的分析讨论，帮助学生掌握方法学验证的思路、内容和过程，并培养学生运用所学知识解决实际问题的能力、交流合作和探索意识。

1 叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法学验证试验方案设计

将企业产品检测方法学验证项目转化为本科生综合设计试验，可作为高职本科三年级食品营养与健康专业学生的功能性食品开发与评估综合实训试验内容，试验学时设计为12学时。叶黄素咀嚼片是以叶黄素微粒为主要原料，辅以木糖醇、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、硬脂酸镁，经混合、制粒、干燥、压片等工艺制成的经人体试食试验证明具有缓解视疲劳功能的保健食品，其功效成分叶黄素含量为2.22%。由于该产品功效成分检验方法没有标准方法，需要建立该产品的质量标准，需要对所建立的方法进行验证，说明所建立的方法适合于该产品的检测要求，能用于该产品的质量控制。

试验前，教师指导学生利用学校图书馆和线上资源查找相关文献、整理相关资料，制定方法学验证方案，帮助学生熟悉和掌握含量测定方法学验证的目的、内容和指标限定要求。2～3名学生为1组，全部学生分成多个小组，以学生为主，在教师辅导下撰写、修改完善试验方案。叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法参考浙江制造团体标准T/ZZB 0405——2018《复配食品添加剂 叶黄素微粒》[13]中叶黄素含量测定方法确定，采用紫外-可见分光光度法测定叶黄素咀嚼片中叶黄素的含量，确定验证方案中方法学验证项目[14-15]包括专属性、线性、精密度、准确度、稳定性等，具体方法学考察项目见表1。

表1 叶黄素含量测定的方法学考察项目安排

2 叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法学验证试验实施[13-14]

叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法学验证方案采用2～3名学生为1组，全班学生分成多个小组的方式来进行验证实施，利用紫外-可见分光光度法分别探讨叶黄素咀嚼片中功效成分叶黄素含量测定方法的专属性、线性及范围、精密度、准确度、溶液稳定性。验证试验实施过程包括溶液的配制、分光光度法测试、数据处理与分析、试验报告等多个环节，此过程通过实践让学生进一步掌握含量测定方法学验证的思路和内容、验证过程和结果的评价。试验过程中需要小组学生之间分工与协作，在试验数据处理与分析中需要学生之间的交流与合作，因此试验也训练了学生综合运用所学知识解决实际问题的能力，在实践中交流合作，科学探索。

2.1 叶黄素咀嚼片中功效成分叶黄素的测定方法

2.1.1 供试品溶液的制备

取3片叶黄素咀嚼片，研磨碎后，准确称取约450 mg（相当于10 mg叶黄素）供试品置于100 mL容量瓶中，加5 mL纯化水，在60 ℃水浴中超声溶解5 min，用冷却水冷却至室温，无水乙醇稀释定容至刻度，摇匀。过滤，弃去最初的2 mL滤液。吸取1 mL上述过滤液于50 mL容量瓶中，无水乙醇稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.1.2 测定

用1 cm石英比色杯，以无水乙醇作为空白，在最大吸收波长446 nm处测定供试品溶液的吸光度A，按式（1）计算叶黄素咀嚼片中叶黄素的含量（T，%）。

式中：A为供试品溶液的吸光度；W为称取供试品量，g；2 550为叶黄素的吸收系数；5 000为稀释倍数。

2.2 叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法学验证试验过程

2.2.1 专属性

专属性主要考察试剂、辅料存在下，采用的检测方法能否正确测定出功效成分的能力。小组内学生分工协作按照2.1项测试方法配制试剂空白、1.5倍空白辅料（精确称取675 mg空白辅料）溶液、对照品溶液、供试品溶液，用1 cm石英比色杯，以无水乙醇作为空白，分别记录400～500 nm扫描图（见图1）。结果表明，空白辅料样品、试剂空白在446 nm处均无吸收峰；供试品溶液和对照品溶液的谱图峰形相似且在446 nm均有最大吸收峰，表明该方法专属性良好。

图1 叶黄素含量测定专属性结果

2.2.2 线性

线性是测试在设计的范围（相对浓度70%，90%，110%，130%和160%）内，线性试验结果与试样中功效成分叶黄素浓度直接呈比例关系的能力。采用同一对照品储备液经精密稀释制备5个不同浓度水平的方法来观察是否线性，并进行线性回归。

精确称取20 mg叶黄素工作标准品至100 mL棕色容量瓶中，加20 mL无水乙醇，在60 ℃水浴中超声溶解5 min，用冷却水冷却至室温，无水乙醇稀释定容至刻度，摇匀。吸取10 mL上述溶液置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制得质量浓度20μg/mL叶黄素标准储备液。分别移取0.7，0.9，1.1，1.3和1.6 mL的叶黄素标准储备液至10 mL容量瓶中，加无水乙醇稀释定容至刻度，摇匀，制得相对浓度为70%（1.4 μg/mL），90%（1.8 μg/mL），110%（2.2μg/mL），130%（2.6 μg/mL）和160%（3.2 μg/mL）的对照品溶液。按照2.1的测试方法测定其吸光度，以所测得的吸光度为纵坐标，以溶液中叶黄素浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程式及相关系数（r）和Y轴偏差（见表2）。从线性考察可知，叶黄素的线性回归方程相关系数（r）和Y轴偏差均符合表1中r≥0.999、Y轴偏差≤0.050的要求。由此可见，叶黄素含量测定方法在1.4～3.2 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。

表2 叶黄素含量测定线性关系考察结果

各个品牌的分光光度计测试吸光度的原理和过程都一样，每个仪器的操作又略有不同，有些学生操作仪器时还是无从下手。为此，通过超星学习通平台上传分光光度计的操作视频，供学生自主学习和课后复习，学生可以随时反复观看，强化知识和技能。另外，试验中标准曲线的制备要求学生通过Excel软件进行标准曲线绘制，但一部分学生无法正确绘制标准曲线和计算相关系数（r）和Y轴截距，除了通过课堂现场演示教学外，建议还可以编写新形态综合实训教材，将Excel软件绘制标准曲线绘制过程制作成二维码，学生随时扫码学习和复习。通过多种方式让学生在线性测试过程中不仅掌握分光光度计的测试原理和操作使用，还学会正确使用Excel软件进行标准曲线绘制与评价。

2.2.3 精密度

含量测定需要考察方法的精密度。精密度是指在规定的测试条件下，同一份样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、相对标准偏差等表示。试验进行重复性和中间精密度测定。在相同条件下，由同一分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同一实验室内，由不同人员、在不同时间、不同设备等测定结果之间的精密度称为中间精密度。精密度测试小组成员扮演分析员甲和乙，分别在规定条件下、规定浓度用至少6份样品的测试结果进行评价。

重复性（分析员甲）：精密称取6份叶黄素咀嚼片样品450 mg至100 mL棕色容量瓶中，按照2.1的测试方法测定其吸光度，计算样品中叶黄素含量和SRSD（见表3）。

表3 叶黄素含量测定重复性考察结果

中间精密度（分析员乙）：在不同的日期，分别精密称取6份450 mg同批次叶黄素咀嚼片样品至100mL棕色容量瓶中，按照2.1的测试方法测定其吸光度，计算样品中叶黄素含量和SRSD。不同分析员测定结果相比较，计算其SRD（见表3）。

重复性（分析员甲）测试中含量SRSD=1.0%（n=6），中间精密度（分析员乙）测试中SRSD=0.9%（n=6），不同分析员测试结果SRD=4.5%，均符合表1中SRSD≤2.0%，SRD≤5.0%的要求，说明叶黄素含量测定方法的精密度良好。

精密度考察中SRSD计算是一个难点，可通过将复杂的计算过程制作成微课以二维码在教材或学习通线上资源的形式呈现，将复杂的计算过程以直观易懂的方式传授给学生，并学以致用。

2.2.4 准确度

准确度是指所建立方法测定的结果与真实值的接近程度，一般用回收率（%）表示。试验中采用规定检测浓度的70%，100%和130%，一式三份，以在空白辅料中加入已知量功效成分对照品进行测定。

精密称取约50 mg叶黄素对照品至50 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀，作为准确度测试储备液。精密称取450 mg空白辅料，共9份，分别加入7.0，10.0和13.0 mL的准确度测试储备液，按照2.1.1的方法制备供试品溶液，制得检测浓度70%，100%和130%的准确度测试加标溶液。按照2.1.2的方法测定其吸光度，计算加标回收率和SRSD（见表4）。

表4 叶黄素含量测定准确考察结果

准确度测试中平均回收率为99.6%，SRSD=0.4%（n=9），回收率和平均回收率均在95.0%～105.0%之间，符合表1中回收率在95.0%～105.0%之间，SRSD≤2.0%的要求，表明叶黄素含量测定方法的回收率好、准确度高。

2.2.5 溶液稳定性

按照2.1.1的方法配制供试品溶液1份，常温放置，分别在配制后0，2，4，6和8 h按照2.1.2的测试方法测定其吸光度，计算叶黄素含量，并与0 h测定结果相比较，计算其SRD（见表5）。由溶液稳定性测试结果可知，溶液放置2，4，6和8 h后含量与新鲜配制溶液（0 h）含量的SRD均小于5.0%，符合表1中稳定性的要求，说明叶黄素含量测定方法具有良好的稳定性。溶液稳定性测试需要进行8 h，所以整个试验的时间安排上也要做好整体规划。

表5 溶液的稳定性测试结果表

2.3 课后试验拓展

试验采用吸收系数法进行叶黄素咀嚼片中功效成分叶黄素含量测定的方法学验证，进行专属性、线性、精密度、准确度和溶液稳定性等项目的考察测试，内容丰富，综合性强。在此基础上，可对试验进行进一步的拓展，可通过查资料进一步探索采用HPLC法测定叶黄素咀嚼片中功效成分含量测定方法学验证指标和过程。HPLC法进行含量测定的方法学验证在此试验考察项目的基础上，还要增加检测限、定量限、耐用性等测试，请学生课后设计相关的测试考察过程，激发学生的自主学习能力和思维拓展，举一反三加深学生对方法学验证的理解和经验积累。

3 结语

试验以紫外-可见分光光度法定量分析中的吸收系数法进行叶黄素咀嚼片中功效成分叶黄素含量测定方法的验证试验设计，通过对专属性、线性、精密度、准确度和溶液稳定性等指标的考察，证明叶黄素咀嚼片中功效成分叶黄素含量测定方法准确、稳定、可靠，可用于叶黄素咀嚼片质量控制和功效成分含量的测定。该试验教学模式集含量测定方法学验证理论学习、试验操作、数据处理与分析为一体，提升学生综合运用所学知识解决实际问题的能力，为后续深造、毕业后从事相关工作打下坚实基础。