强肾汤对2—3期慢性肾脏病脾肾气虚证代谢组学的影响*

赵昶潞,尹聪,高继宁

1.山西中医药大学,山西 太原 030024; 2.山西省中西医结合医院,山西 太原 030024

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是肾脏内科临床常见难治性疾病,具有发病率高、早期知晓率低、并发症多、预后差等特点[1-2]。中医认为,本病属“水肿”“肾风”等范畴。该病初期以尿血、尿浊、水肿为主要表现,中后期逐步发展为癃闭、关格等危重证候。临床认为,本病病变部位在肾,与脾功能密切相关。本病中医证型包括脾肾阳虚证、脾肾气虚证、肝肾阴虚证、脾肾气阴两虚证、阴阳两虚证;兼证包括湿浊证、湿热证、水气证、血瘀证和风动证[3]。

笔者认为,脾肾亏虚、湿毒瘀阻是CKD核心病因病机,提出 “以肾为主,五脏同调,通腑降浊化瘀”的治疗原则,所创强肾汤治疗CKD早期脾肾气虚证取得了很好的临床疗效,可有效延缓肾脏纤维化和肾功能损伤的进展,改善患者症状,减少蛋白的漏出,从而保护肾功能。本研究拟采用液相色谱-质谱联用分析技术检测CKD 2—3期脾肾气虚证患者经强肾汤治疗前、治疗后1周的血清代谢谱差异,并进一步分析强肾汤的作用机制,以期从代谢层面阐释强肾汤的科学内涵,为该方的合理应用提供科学依据,现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

1.1.1 西医诊断标准CKD诊断标准参照改善全球肾病预后组织指南[3]。任何原因所致的肾脏病理学异常或血、尿、影像学检查异常或肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)<60 mL·min-1·1.73 m-2,并持续3个月,包括各类肾小球、肾小管间质或肾血管疾病。CKD 1期:eGFR≥90 mL·min-1·1.73 m-2;CKD 2期:60≤eGFR<90 mL·min-1·1.73 m-2;CKD 3期:30≤eGFR<60 mL·min-1·1.73 m-2;CKD 4期:15≤eGFR<30 mL·min-1·1.73 m-2;CKD 5期:eGFR<15 mL·min-1·1.73 m-2或透析。

1.1.2 中医辨证标准参照《中药新药临床研究指导原则》提出的辨证原则。脾肾气虚证:主症:神疲乏力,少气懒言,动则气促,纳差便溏,腰膝酸软;次症:自汗易外感,口淡不渴;舌淡有齿痕;脉弱。

1.2 病例纳入标准(自拟)(1)年龄为18～75岁,性别不限;(2)符合西医慢性肾脏病诊断标准,且eGFR为30～89 mL·min-1·1.73 m-2;(3)符合中医脾肾气虚证诊断标准;(4)感染、酸中毒、电解质紊乱、高血压得到有效控制;(5)自愿参加,能够完全理解试验且签署知情同意书[4]。

1.3 病例排除标准(自拟)(1)各种原因导致的急性肾衰竭患者、慢性肾功能不全急性加重者;(2)妊娠期、围生期及哺乳期患者;(3)有心、肝、脑及造血系统严重原发病者;(4)无法合作者,如:精神疾病者;(5)CKD已经开始肾脏替代治疗者;(6)合并有活动性感染疾病者。

1.4 一般资料选择2021年9月至2022年9月在山西中医药大学附属山西省中西医结合医院肾病三科就诊的CKD 2—3期脾肾气虚证患者35例,均为脾肾气虚证组(服药前为PA组,用药1周后为TP组);健康组(NL组)35例来源为本科室患者家属志愿者,均签署知情同意书,自愿参与本课题研究。脾肾气虚证组与健康组的性别、年龄等资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性,见表1。

表1 两组一般资料比较

1.5 治疗方法除基础治疗外,所有患者均给予强肾汤。方药组成:黄芪30 g,当归15 g,桃仁10 g,红花15 g,川芎30 g,制何首乌15 g,积雪草30 g,金蝉花15 g,鳖甲20 g,大黄炭10 g,车前子30 g,枳实 10 g,厚朴10 g,砂仁6 g,甘草6 g。每日1剂,早晚分服,连续服用1周。以上中药饮片均由山西中医药大学附属山西省中西医结合医院中药房提供,开水冲调,每次150 mL,每天两次,连续口服7 d。

1.6 检测方法

1.6.1 样本采集与处理分别空腹采集治疗前、治疗后1周所有患者全血样品,置肝素钠采血管室温静置30 min,离心(15 min,3 500 r·min-1,4 ℃),取上清液分装到1.5 mL EP管,每管0.5 mL,分批贮存-80 ℃冰箱中。检测前样品在4 ℃环境解冻 30 min 后取样品100 μL于1.5 mL EP管中,加入400 μL预冷的甲醇-乙腈溶液(1：1),涡旋混匀 1 min,离心(15 min,13 000 r·min-1,4 ℃),取上清液加至新的1.5 mL EP管,离心浓缩至干,进样前加入 150 μL 20%甲醇(质谱级)复溶,离心(15 min,13 000 r·min-1,4 ℃),吸取上层血清供检测。

1.6.2 样本测试分析血清样本通过超高效液相色谱仪(日本岛津公司)结合Triple TOF 5600+质谱仪(美国AB Sciex公司)进行测定,液相条件为流速:0.2 mL·min-1,流动相为甲酸水(A)和乙腈(B)(赛默飞世尔科技有限公司);质谱条件为离子源参数:雾化气:55 Psi;辅助气:55 Psi;气帘气(CUR):30 Psi;雾化温度(TEM):450.0 ℃;喷雾电压(ISVF):5 500 V。MS/MS参数:去簇电压(DP):±60 V;数据采集范围:50～1 500m/z;碰撞能量(CE):±30 eV;碰撞能量范围(CES):15 eV。

1.7 观察指标(1)临床疗效。(2)治疗前后24小时尿蛋白定量。(3)治疗前后血清肌酐(serum creatinine,Scr)、肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、β2微球蛋白(β2microglobulin,β2-MG)及胱抑素C(Cystatin-C,Cys-C)水平。(4)治疗前后血红蛋白水平、血浆白蛋白水平。

1.8 临床疗效判定标准根据《中药新药临床研究指导原则》中的证候疗效判定标准,拟定“CKD 2—3期中医证型量化统计表”,对试验组患者进行调查,并于治疗前、治疗后1周详细记录患者的四诊情况。调查表内容主要包括中医症状和体征共21个变量,并将每一症状分三等级,即轻、中、重度,分别为0、1、2分。采用尼莫地平法计算疗效指数并判定疗效。其中,疗效指数≥95%为痊愈;70%≤疗效指数<95%为显效;30%≤疗效指数<70%为有效;疗效指数<30%为无效。

疗效指数=[(治疗前积分-治疗后积分)/治疗前积分]×100%

1.9 数据分析方法液相色谱-质谱联用导出的数据通过One-MAP转化,再经归一化处理后,导入SIMCA 13.0软件进行无监督的主成分分析(principal component analysis,PCA),再用有监督的偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(orthogonal PLS-DA,OPLS-DA)找出样品间差异变量。模型检验分别采用排列实验(permutation test)和CV-ANOVA进行分析。显著性差异通过曼惠特尼U检验,P<0.05为差异有统计学意义。若模型检验不通过,则采用火山图(Volcano Plot)进行单变量分析。差异变量通过检索数据库METLIN(http://metlin.scripps.edu)、HMDB(www.hmdb.ca/metabolites、KEGG和 LIPID) 进行代谢物定性鉴定。

2 结果

2.1 CKD患者治疗前后证候积分比较治疗1周后,痊愈0例(0.0%),有效31例(88.6%),无效4例(11.4%),见表2。

表2 CKD患者治疗前后证候积分比较 分)

2.2 CKD患者治疗前后实验室指标比较治疗后,24小时尿蛋白定量、Scr、BUN、β2-MG、Cys-C水平显著降低(P<0.01),GFR、血红蛋白、血浆白蛋白显著升高(P<0.01),见表3。

表3 CKD患者治疗前后实验室指标比较

2.3 血清LC-MS检测结果

2.3.1 血清QC样本LC-MS总离子流图分析在不同质谱扫描模式下,血清中代谢响应不同,见图1。

注:A:正离子模式;B:负离子模式。图1 正、负离子模式下血清LC-MS总离子流图

2.3.2 CKD患者治疗前后血清样本差异分析首先采用PCA对强肾汤治疗前后患者血清代谢表型进行分析,见图2。PA组和TP组中样本有重叠现象,表明二者之间代谢物存在较小的差异。进一步进行有监督的PLS-DA分析,相应的排列试验结果显示,左边所有排列值均低于右边原始值,表明模型不成立(图3)。进一步采用Volcano Plot(图4)进行单变量分析,筛选影响二者分组的差异变量,并通过HMDB数据库和文献数据对照,进行代谢物鉴定。结果表明,与PA组比较,TP组中包括鞘氨醇、甘油磷脂、羟谷氨酸等9个代谢物含量显著升高,而脂肪酸18：0、磷酸乙醇胺36：2 h和SM(d18：1/16：0)共3个代谢物水平显著降低,表明经强肾汤治疗1周后对2—3期慢性肾脏病脾肾气虚证有一定的治疗作用,代谢产物具体变化趋势见表4。

注:A:正离子模式;B:负离子模式。图2 离子模式下PA组和TP组样本PCA图

注:A:正离子模式;B:负离子模式。图3 离子模式下PA组和TP组PLS-DA permutation test图

注:A:正离子模式;B:负离子模式。图4 离子模式下PA组和TP组Volcano图

表4 患者治疗前后血清中差异代谢物的变化趋势

2.3.3 代谢通路分析将上述差异代谢物输入Metaboanalyst网站中进行通路分析,图中圆点越大表示该途径在整体代谢轮廓中占的比重越大,颜色越深表示该通路越显著,作用越明显。在此基础上,综合RawP值(P<0.05)、FDR(false discovery rate)和Impact(0.01)值共发现两条主要的代谢通路:甘油磷脂代谢、鞘脂代谢,推测它们与强肾汤治疗2—3期慢性肾脏病脾肾气虚证患者密切相关,见图5。

图5 强肾汤治疗2—3期慢性肾脏病脾肾气虚证患者血清代谢物的代谢途径分析

3 讨论

代谢组学是对内源性代谢物定性定量分析,是寻找代谢物与机体生理病理变化关系的研究方法[5]。代谢组学已广泛应用于生命科学研究及医药学相关领域,对疾病的代谢轮廓及通路、早期诊断、药物疗效、预后等方面都有重大意义[6]。将代谢组学技术应用于中医临床,有助于实现从系统生物学角度阐释中医奥秘,以阐明中药方剂的作用及机制。

强肾汤具有补肾健脾、化瘀通腑降浊的作用,治疗CKD早期脾肾气虚证可取得很好的临床疗效。方中黄芪、当归可健脾补肾,大黄、鳖甲攻下逐瘀,积雪草、车前子利水渗湿。诸药合用,可缓解患者浮肿、小便不利、气短乏力等症状。研究证实,黄芪甲苷可降低尿蛋白[7],制何首乌、大黄可改善GFR、Scr等肾功能指标[8-9],积雪草、金蝉花可抑制肾脏细胞凋亡,增强肾小球滤过作用[10-11],川芎、当归可提高体内血红蛋白水平[12-13],鳖甲可通过影响肾间质成纤维细胞功能以延缓肾纤维化[14-15]。

本研究基于LC-MS代谢组学技术研究表明,强肾汤治疗2—3期慢性肾脏病脾肾气虚证的作用机制可能与调节鞘脂代谢和甘油磷脂代谢密切有关。细胞内鞘脂代谢即以神经酰胺的合成和分解为核心的脂质代谢,其中鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和神经酰胺-1-磷酸(C1P)是神经酰胺在神经酰胺酶作用下的分解产物[16]。有研究表明,鞘脂代谢异常与肾小球疾病密切相关,主要通过损伤足细胞功能、影响脂肪酸氧化、参与胰岛素抵抗等,从而加重肾损伤[17]。C1P和S1P代谢改变会损伤细胞膜脂筏结构域的完整性,另鞘脂类有毒脂质代谢产物堆积直接导致足细胞损伤,影响肾小球滤过功能,加重肾损害。同时,C1P是一种重要的炎症调节因子,参与细胞氧化增殖[18];S1P与蛋白尿的产生有关。研究证实,S1P的高表达会增加CKD患者活性氧的生成,影响线粒体氧化功能,加重肾损伤[19]。研究发现,CKD 2—3期患者及正常组织细胞中鞘脂代谢水平存在显著差异,通过调控神经酰胺代谢来减少足细胞损伤,保护肾功能成为一种新的治疗手段[20]。本研究结果显示,35例患者经强肾汤治疗后血清中鞘氨醇、羟谷氨酸等代谢物水平显著升高,脂肪酸 18：0、SM(d18：0/16：0)等代谢物水平显著降低,提示强肾汤延缓肾损伤,保护肾功能的作用可能与调节鞘脂代谢、下调神经酰胺水平有关。

CKD的发病机制与甘油磷脂代谢紊乱密切相关,机体内甘油磷脂通过磷脂酶降解实现磷脂代谢,不同磷脂酶作用不同酯键。磷脂酶A2可催化磷脂裂解产生游离的溶血磷脂,具有肾毒性,可损伤肾功能,加快肾功能衰退[21]。同时磷脂酶活性催化,加快与磷脂结合,破坏线粒体稳定性,增加细胞炎症反应。磷酸乙醇胺是甘油磷脂的代谢产物,激化肾脏氧化应激,造成肾动脉硬化[22]。溶血磷脂酰胆碱作为磷脂酰胆碱合成的中间产物,同样参与细胞膜的信号转导,能降低血浆胆固醇水平。服药后患者血清中溶血磷脂酰胆碱、甘油磷脂酰胆碱水平升高,磷酸乙醇胺水平降低,提示该药可抑制血清中甘油磷脂代谢,从而有效保护肾内皮细胞,稳定肾功能。

综上,强肾汤通过调节鞘脂代谢和脂肪酸代谢等途径稳定脂质代谢,鞘脂代谢和甘油磷脂代谢均为磷脂代谢问题;磷脂代谢直接与线粒体相关,线粒体产能和代谢决定氧自由基(reactive oxygen species,ROS)合成、凋亡,进而导致肾组织的氧化应激,造成肾组织损伤。一方面,磷脂是线粒体膜的主要成分,磷脂代谢紊乱影响线粒体膜的稳定性,影响ROS生成、凋亡[23]。另一方面,磷脂代谢受损造成线粒体的数量、质量减少,也会使机体ATP合成减少,ROS生成增加,影响细胞的增殖、凋亡,损伤肾细胞;线粒体内ROS生成增多及清除不足最终导致ROS爆发,引起肾组织氧化应激,损伤肾功能。因此,可认为强肾汤通过调节线粒体磷脂膜的稳态来修复、预防线粒体损伤,发挥线粒体保护剂功能,从而延缓肾脏损伤,保护肾功能。

强肾汤通过调节磷脂代谢以防止脂质堆积,保护肾功能。脂质作为机体供能的重要来源,其消化吸收场所在小肠。小肠主液,泌别清浊,其受盛化物就是营养物质的消化吸收。脂质为饮食水谷消化后的精微,后经运化传输布散周身。CKD 2—3期脾肾气虚证的患者,肾中元气亏耗无以濡养小肠,影响小肠化物之功;脾气不足,水谷精微运化不利,蕴积日久而化瘀浊,更损正气;则会出现倦怠乏力、气短懒言、浮肿难消、肢体困重、面色晦暗、脘腹胀满等正虚邪实的表现。强肾汤中黄芪、当归益气补血、健脾益肾;桃仁、红花、大黄炭、车前子活血行气、利湿化浊。本方以调补脾肾为基,加以通腑降浊化湿,以达扶正祛邪之功。

本研究从系统生物学角度分析强肾汤治疗2—3期慢性肾脏病脾肾气虚证的作用机制,为中医治疗早期CKD的现代研究提供了新思路,也为强肾汤的临床应用提供科学依据。今后的研究还应扩大样本量,可减少年龄、性别、原发病等对试验结果的影响。基于代谢组学整体性、灵敏性的特点,分析复杂中医证型本质、中药方药机制对中药现代化研究具有重要意义。