山楂酸通过调节HMGB1/TLR4信号通路抑制炎症反应和细胞凋亡保护急性肺损伤的研究

柯维强,陈小玲,蔡杨靖

(海南医学院第二附属医院,海南 海口 570216)

急性肺损伤是由多种致病因素引起的急性弥漫性炎症性肺损伤,是一种机体过度炎症反应综合征,其主要特征为严重低氧血症、肺水肿、肺中重度中性粒细胞积聚等,具有较高的病死率[1]。脂多糖(LPS)感染是导致急性肺损伤的常见原因,LPS可结合细胞表面受体,调控包括炎症信号通路在内的多种信号转导通路,激活氧化应激和炎症级联反应,刺激肺部发生弥漫性损伤[2-3]。急性肺损伤的发病机制尚未完全阐明,促炎/抗炎反应失衡、氧化/抗氧化失衡等均与该病的发生发展有关,目前仍没有有效的药物治疗方法[4],其发病机制和治疗策略一直是研究的焦点。山楂酸是一种五环三萜类天然活性物质,主要从橄榄中分离得到,其具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗菌、神经保护、肝保护等生物学特性[5]。Lee等[6]研究发现,在LPS处理的人脐静脉内皮细胞和小鼠肺组织损伤中,山楂酸通过调控相关炎性细胞因子表达发挥重要的抗炎作用。Hsia等[7]研究报道,山楂酸可通过介导线粒体凋亡和缺氧诱导因子(HIF)-1α通路对肺癌A549细胞产生细胞毒作用,具有抗肺癌活性。Jeong等[8]研究发现,山楂酸可通过Toll样受体4(TLR4)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-自噬途径抑制炎症细胞浸润,减轻颗粒物诱导的肺损伤。上述研究提示山楂酸可能是一种治疗炎症性疾病的理想药物。本实验基于介导炎症反应的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)信号通路,探讨了山楂酸对LPS诱导的急性肺损伤大鼠的肺保护作用,以为临床研发治疗急性肺损伤的药物提供客观依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级健康雄性SD大鼠78只,6～8周龄,体重180～220 g,购自海南药物研究所有限责任公司,生产许可证号:SCXK(琼)2020-0007。饲养环境:温度18～24 ℃,相对湿度50%～70%,标准饲料喂养,自由饮水、进食。本实验经海南医学院第二附属医院动物伦理委员会审批(K20220318076)。

1.2药物、试剂及仪器 山楂酸购自成都乐美天医药科技有限公司(纯度≥98.0 %,规格:20 mg);地塞米松磷酸钠注射液购自国药集团容生制药有限公司(国药准字H41020036,规格:1 mL∶5 mg);LPS购自北京索莱宝科技有限公司(纯度≥98.0 %,规格:100 mg);HE染色试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液、ECL购自武汉博尔夫生物科技有限公司;IL-6、IL-8、TNF-α ELISA试剂盒购自武汉博士德生物技术公司;TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司;GAPDH、HMGB1、TLR4抗体,辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗均购自武汉菲恩生物科技有限公司。R407小动物呼吸机购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司;MK3酶标仪购自美国Thermo公司;光学显微镜购自日本Olympus公司;JP-2880全自动凝胶成像分析系统购自上海金鹏分析仪器有限公司。

1.3实验方法 大鼠饲养1周并称重后,随机选取15只作为正常组,给予腹腔注射5 mg/kg生理盐水,其余大鼠腹腔注射5 mg/kg LPS制备急性肺损伤模型。造模后观察大鼠出现呼吸短促、精神萎靡,病理组织形态学观察到大鼠肺泡有充血及出血,肺泡腔中聚集大量中性粒细胞,并且肺组织湿/干重比值明显升高即表示造模成功。将造模成功的60只大鼠随机分为肺损伤组、山楂酸低剂量组、山楂酸高剂量组、地塞米松组,每组15只。造模成功后第2天,山楂酸低剂量组大鼠腹腔注射25 mg/kg山楂酸溶液,山楂酸高剂量组大鼠腹腔注射100 mg/kg山楂酸溶液,地塞米松组大鼠腹腔注射2 mg/kg地塞米松注射液,正常组和肺损伤组大鼠均腹腔注射等量生理盐水,均1次/d,连续注射8周。

1.4检测指标及方法

1.4.1肺组织湿/干重比值 各组大鼠末次注射后禁食12 h,腹腔注射1%戊巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉后,取右肺,用超纯水清洗,滤纸吸干肺表面水分,称取肺重量,标记为湿重,然后将肺置于60 ℃恒温干燥箱中干燥48 h,再次称取肺重量,标记为干重,计算肺组织湿/干重比值。

1.4.2肺组织病理形态 取各组大鼠左肺,用4%多聚甲醛溶液固定24 h,石蜡包埋,制成6 μm的切片,根据HE染色试剂盒进行HE染色,封片后置于光学显微镜下拍照、观察。

1.4.3支气管肺泡灌洗液中炎性因子含量 大鼠麻醉取肺组织前,用预冷的生理盐水注入气管行肺泡灌洗,重复3次收集支气管肺泡灌洗液,于4℃、3 000 r/min离心20 min收集上清液,根据ELISA试剂盒检测IL-6、IL-8、TNF-α含量。

1.4.4肺组织细胞凋亡情况 将大鼠肺组织石蜡切片脱蜡至水,加入3% H2O2溶液浸洗10 min,随后用蛋白酶K工作液修复,按照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书操作染色,封片后置于荧光显微镜下采集图像,计算细胞凋亡率,其中阳性细胞呈绿色荧光,正常细胞呈蓝色荧光。

1.4.5肺组织中HMGB1和TLR4蛋白表达情况采用Western blot法检测:使用RIPA缓冲液提取大鼠肺组织的总蛋白,用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。将提取的蛋白于95 ℃煮沸5 min,取等量的蛋白经10% SDS-PAGE分离,电转移到PVDF膜上。随后用5%脱脂牛奶封膜2 h,用稀释的HMGB1(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、GAPDH (1∶5 000)一抗在4 ℃孵育过夜,经过TBST洗膜,HRP标记的二抗于室温孵化1.5 h,利用ECL发光液显影,凝胶成像系统采集图像,Image J图像软件分析蛋白灰度值。

2 结 果

2.1各组大鼠肺组织湿/干重比值 肺损伤组大鼠肺组织湿/干重比值明显高于正常组(P<0.05);山楂酸低、高剂量组和地塞米松组大鼠肺组织湿/干重比值均明显低于肺损伤组(P均<0.05),且山楂酸高剂量组和地塞米松组均明显低于山楂酸低剂量组(P均<0.05),山楂酸高剂量组和地塞米松组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.2各组大鼠肺组织病理形态 正常组大鼠肺组织结构完整,肺泡间隔均匀,肺泡腔清晰,未见炎性细胞浸润;肺损伤组大鼠肺组织明显水肿、充血,肺泡间隔变宽,肺间质可见大量炎性细胞浸润;山楂酸低、高剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病变均较肺损伤组轻,肺泡间隔呈轻度增宽,肺间质有少量炎性细胞浸润,且山楂酸高剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病变较山楂酸低剂量组轻。见图2。

2.3各组大鼠支气管肺泡灌洗液中炎性因子含量肺损伤组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α含量均明显高于正常组(P均<0.05);山楂酸低、高剂量组和地塞米松组IL-6、IL-8、TNF-α含量均明显低于肺损伤组(P均<0.05),且山楂酸高剂量组和地塞米松组各指标含量均明显低于山楂酸低剂量组(P均<0.05),山楂酸高剂量组和地塞米松组各指标含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和急性肺损伤各组大鼠支气管肺泡灌洗液中炎性因子含量比较

2.4各组大鼠肺组织细胞凋亡率 肺损伤组大鼠肺组织细胞凋亡率为(36.51±2.60)%,明显高于对照组的(4.43±0.85)%(P<0.05);山楂酸低、高剂量组和地塞米松组大鼠细胞凋亡率分别为(28.33±2.18)%、(17.69±1.74)%、(16.92±1.61)%,均明显低于肺损伤组(P均<0.05),且山楂酸高剂量组和地塞米松组均明显低于山楂酸低剂量组(P均<0.05),山楂酸高剂量组和地塞米松组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组细胞凋亡TUNEL染色见图3。

图3正常组和急性肺损伤各组大鼠肺组织细胞凋亡情况(TUNEL染色,×400)

2.5各组大鼠肺组织中HMGB1-TLR4轴相关蛋白表达情况 肺损伤组大鼠肺组织中HMGB1和TLR4蛋白相对表达量均明显高于正常组(P均<0.05);山楂酸低、高剂量组和地塞米松组HMGB1和TLR4蛋白相对表达量均明显低于肺损伤组(P均<0.05),且山楂酸高剂量组和地塞米松组HMGB1和TLR4蛋白相对表达量均明显低于山楂酸低剂量组(P均<0.05),山楂酸高剂量组和地塞米松组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图4。

图4 正常组和急性肺损伤各组大鼠肺组织中HMGB1-TLR4轴相关蛋白表达情况

3 讨 论

山楂酸存在于中草药、蔬菜、水果等多种天然来源的物质中,对人体有着很高的安全性,因其具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤活性而受到医学界的广泛关注[9]。Li等[10]报道,山楂酸通过降低活性氧水平和抑制炎症细胞因子表达促进胰岛素信号转导,进而改善高糖诱导的人主动脉内皮细胞内皮功能障碍。Yap等[11]报道,山楂酸可以抑制分泌型磷脂酶A2-ⅡA(sPLA2-ⅡA)诱导的巨噬细胞炎症作用。Ampofo等[12]发现,山楂酸可通过抑制核因子-κB(NF-κB)介导的黏附分子表达,减轻缺血/再灌注诱导的组织损伤和炎症反应。Chen等[13]研究显示,山楂酸可通过调控PI3K/Akt/NF-κB途径抑制IL-1β诱导的骨关节炎炎症反应。本实验结果显示,山楂酸能够显著降低LPS诱导急性肺损伤大鼠肺组织湿/干重比值,减轻肺组织病理损伤和炎性细胞浸润,且高剂量山楂酸作用效果与地塞米松的效果相当。提示山楂酸对急性肺损伤具有保护作用,其作用效果与剂量有关。

IL-6、IL-8、TNF-α是促炎细胞因子。研究发现,IL-6过表达的肺疾病患者住院时间明显延长,继发感染的发生率升高,IL-6可作为监测急性肺损伤的生物标志物之一[14]。TNF-α表达水平与急性肺损伤患者生存结局呈负相关,TNF-α表达增加可使肺上皮通透性增加,诱导肺组织损伤和中性粒细胞积聚,导致肺水肿[15-16]。IL-8是一种中性粒细胞激活剂,可与自身抗体结合形成复合物,以复合物的形式激活中性粒细胞的趋化作用,延缓中性粒细胞凋亡,从而加重炎症反应,其可通过抑制肺表面活性剂蛋白A和表面活性剂蛋白B表达水平促进细胞凋亡,抑制细胞活性,最终导致急性肺损伤[17]。多项研究报道,山楂酸可通过降低IL-6、IL-8、TNF-α表达水平减轻炎性反应[18-20]。本实验结果显示,各药物组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α含量均明显降低,且山楂酸高剂量组与地塞米松组IL-6、IL-8、TNF-α含量差异不明显,提示山楂酸可抑制肺组织炎症反应,且高剂量作用效果与地塞米松相当。

在急性肺损伤的发生发展过程中,细胞凋亡与急性肺损伤的严重程度密切相关[21-22]。肺泡上皮细胞、内皮细胞、中性粒细胞和肺泡巨噬细胞等的异常凋亡均可能导致急性肺损伤中上皮屏障功能受损和某些间充质细胞重构[23-24]。此外,不受控制的凋亡途径的激活会引发炎症反应,导致肺组织损伤,这表明抑制凋亡可能是一种有效的急性肺损伤治疗策略[25]。本实验结果显示,山楂酸干预可显著降低急性肺损伤大鼠肺组织细胞凋亡率,提示山楂酸可通过抑制细胞凋亡在急性肺损伤中发挥作用。

HMGB1是一种核蛋白,也是炎症细胞因子,其在炎症反应后期被巨噬细胞释放。HMGB1是TLR4的潜在上游调控因子,HMGB1通过TLR4依赖通路诱导炎症细胞因子释放和产生趋化因子,HMGB1/TLR4信号通路通过不同机制参与包括急性肺损伤在内的多种炎症性疾病[26-27],抑制HMGB1/TLR4信号通路可能在LPS诱导的急性肺损伤过程中发挥保护作用[28]。Li等[29]研究报道,山楂酸可通过调节HMGB1/TLR4信号通路减轻缺血/再灌注损伤心肌炎症和抑制细胞凋亡。本实验结果显示,山楂酸低、高剂量组大鼠肺组织中HMGB1和TLR4蛋白表达量均明显低于肺损伤组,提示山楂酸可能通过抑制HMGB1/TLR4信号通路减轻肺损伤。

综上所述,山楂酸可通过调节HMGB1/TLR4信号通路,抑制炎症反应和细胞凋亡而减轻急性肺损伤,其具体作用机制及量效关系还有待研究探讨。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。