敛疮生肌灌肠疗法对溃疡性结肠炎大鼠IL-6、IL-10、NF-κBp65、ICAM-1表达的影响

刘竺华,李立娟,任顺平,李宝乐,郝海蓉,李佩芳,张小强,陈 翩

(1. 山西中医药大学附属医院,山西 太原 030024;2. 中铁十七局有限公司中心医院,山西 太原 030024;3. 山西省针灸医院,山西 太原 030024;4. 武汉赛维尔生物科技有限公司,湖北 武汉 430000)

溃疡性结肠炎是一种慢性炎症性疾病,通常始于青年时期,并持续终身,除了影响工作和生活外,还可诱发结直肠癌[1]。目前西医主要采用5氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等治疗,效果不太理想[2]。中医认为活动期溃疡性结肠炎属于“疮疡”疾病范畴,其治疗亦可参照疮疡的治则。大量研究证实中药保留灌肠是治疗溃疡性结肠炎的有效方法[3]。本课题组前期研究表明敛疮生肌灌肠疗法可以显著降低溃疡性结肠炎大鼠血清及结肠组织中 白细胞介素-1β(IL-1β)的含量,从而修复受损的结肠组织[4],但其作用机制尚未完全明确。本实验旨在通过观察溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜组织中白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、核转录因子κBp65(NF-κBp65)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达情况,探讨敛疮生肌灌肠疗法调节肠黏膜免疫炎症反应的机制,为本法治疗溃疡性结肠炎提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD大鼠30只,雌雄各半,体重(200±30)g,购自北京维通利华实验动物有限公司,实验动物使用许可证号:SYXK(鄂)2020-0101。大鼠饲养于SPF级动物实验室,温度22～24 ℃,湿度50%～60%,12 h明暗循环,饲料和饮用水消毒后由动物自由摄取。

1.2试剂与仪器 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)原液(5%水溶液,Sigma,货号:P2297-10ML),50%乙醇溶液(国药集团化学试剂有限公司,货号:10009218),10%水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司),4%多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司),石蜡油(国药集团化学试剂有限公司),IL-6和IL-10 ELISA检测试剂盒,NF-κBp65免疫组化试剂盒,RT-PCR半定量分析试剂盒(Bio-rad)。

1.3实验药物 自拟敛疮生肌方(由青黛5 g、枯矾10 g、赤石脂10 g、炉甘石10 g、血竭10 g组成),药材由山西中医药大学附属医院提供。按组方称取药材,加10倍水煎煮1 h,过滤药液后,加5倍水继续煎煮1 h,过滤,合并滤液,浓缩成药量为0.45 g /mL的浓缩液。大鼠每日灌肠剂量参照实验动物与人的体表面积比值表[5]来计算,实验大鼠用量大约为2 mL,溶液置于4 ℃的冰箱保存备用,灌肠前需温热。

1.4实验方法 大鼠适应性饲养1周后,随机取10只大鼠作为正常组;剩余20只大鼠参照文献[5-6]中方法建立溃疡性结肠炎模型,造模成功后将大鼠随机分为模型组、敛疮生肌组,每组10只。造模方法:大鼠禁食(不禁水)24 h后,采用10%水合氯醛麻醉大鼠,将石蜡油充分润滑的硅胶管缓缓插入大鼠肠腔内,一次性从硅胶管内注入按1∶1比例混合的TNBS和 50% 乙醇溶液0.25 mL,提起大鼠尾部,另一只手捏紧其肛门,将其持续倒置约5 min。造模结束后,使动物平躺,自然清醒,自由饮食。观察3 d,以大鼠出现疲倦、懒动、少食、从糊状便到液态血便、体重减轻等表现表示造模成功。从第4天开始,敛疮生肌组给予0.45 g/mL的敛疮生肌方浓缩水煎液2 mL灌肠,模型组、正常组给予等量生理盐水灌肠,灌肠前按摩大鼠腹部及肛门,使其排空粪便,每日定时灌肠1次,连续灌肠7 d。

1.5取材方法 末次灌肠结束后第2天,促使大鼠排便后称重,腹腔注射10%水合氯醛后沿大鼠腹部矢状线打开腹腔,截取肛门之上2 cm到盲肠的整段结肠,沿肠系膜纵向切开,清理粪便,生理盐水反复冲洗后平铺于冰块上,观察肠黏膜充血、水肿、糜烂程度及溃疡大小等。取病变最明显的部分组织5块,2块分装入2个EP管中,对其进行标记存于-80 ℃冰箱,以备RT-PCR半定量分析;2块用4%多聚甲醛固定以备免疫组化及ELISA法检测;1块置于4%甲醛中固定,石蜡包埋后切片,用于HE染色观察。

1.6观察指标

1.6.1一般情况及DAI评分 观察各组大鼠的精神状态、大小便、饮食、皮毛、体重等情况,计算DAI评分。DAI评分=(体重下降分数+大便性状分数+便血分数)/ 3。体重无下降为0分,下降<5%为1分,下降5%～10%为2分,下降>10%～15%为3分,下降>15%为4分;大便性状正常为0分,松散为2分,稀便为4分;便隐血:正常为0分,隐血阳性为2分,显性出血为4分。

1.6.2结肠组织病理评分及病理形态 肉眼和镜下观察结肠黏膜充血、水肿、糜烂情况并进行评分,计算总分为病理评分。肉眼观察评分标准:无损伤,黏膜光滑为0分;黏膜充血、水肿,但未出现溃疡为1分;黏膜充血、水肿,轻度糜烂,无溃疡为2分;黏膜充血、水肿,中度糜烂,有单个溃疡,直径<1 cm为3分;黏膜充血、水肿,高度糜烂,多处溃疡,直径<1 cm为4分;黏膜充血、水肿,重度糜烂,溃疡直径>1 cm为5分。镜下观察评分标准:黏膜固有层无中性白细胞浸润为0分;黏膜固有层有少量中性白细胞(<10个/HPF)浸润,累及少量隐窝为1分:黏膜固有层有明显中性白细胞(10～50个/HPF)浸润,累及 50%以上隐窝为2分;黏膜固有层有大量中性粒细胞(>50个/HPF)浸润,伴隐窝脓肿为3分:固有层明显急性炎症伴溃疡形成为4分。

1.6.3结肠组织中IL-6、IL-10含量 取0.5 mg结肠组织,剪碎后进行超声匀浆, 离心后取上清液,采用ELISA法严格按试剂盒说明检测IL-6、IL-10含量。

1.6.4结肠组织中NF-κBp65蛋白表达情况 采用免疫组化法检测:取制备的结肠组织切片,脱蜡,灭活,血清封闭,加入一抗,PBS冲洗,加入二抗,PBS冲洗,加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗,显色,复染,封片。NF-κBp65蛋白主要表达于大鼠结肠组织中的肠道黏膜及黏膜下层,细胞质中有棕黄色颗粒为阳性细胞表达。颜色越深表达越强,未出现黄绿颗粒则为阴性。采用全自动图像分析仪与图像分析系统测定所采集图像的平均光密度。

1.6.5结肠组织中ICAM-1 mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测:取结肠上皮组织100 mg,加1 mL Trizol制成组织匀浆,提取总RNA。取总RNA 2 μL按照反转录试剂盒说明书方法合成cDNA,合成后测cDNA浓度,备用。GADPH上游引物序列为5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’,下游引物序列为5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’,片段长度138 bp;NF-κB p65上游引物序列为5’-TGTCAAACGGGAGATGAATGG-3’,下游引物序列为5’-CTGGCGGTAATAGGTGTAAATGG-3’,片段长度187 bp。反应条件:94 ℃变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸24 s,共32个循环,72 ℃终末延伸5 min。相对定量法计算ICAM-1 mRNA的2-ΔΔCt值。

2 结 果

2.1大鼠一般情况及DAI评分 造模后大鼠开始出现不喜动,进食少,精神差,拱背扎堆,粪便性状改变等表现,实验过程中模型组死亡1只;敛疮生肌组大鼠灌胃后精神、食欲、排便情况较前逐渐好转,体重增加,无死亡大鼠。正常组大鼠DAI评分为0分,模型组为(3.11±0.50)分,敛疮生肌组为(2.63±0.46)分:模型组DAI评分明显高于正常组和敛疮生肌组(P均<0.05)。

2.2大鼠结肠组织病理评分 正常组、模型组、敛疮生肌组结肠组织病理评分分别为(0.50±0.34)分、(2.67±0.87)分、(1.50±1.08)分,模型组结肠组织病理评分明显高于正常组和敛疮生肌组(P均<0.05)。

2.3大鼠结肠组织病理形态 HE染色显示,正常组结肠组织各层结构清晰,黏膜上皮完整,肠腺数量丰富,细胞形态正常;模型组黏膜及黏膜下层有较多的炎性细胞浸润,伴有多处浅表及深溃疡形成,坏死灶边缘少量肠腺扩张,形状不规则;敛疮生肌组可见少量炎性细胞浸润。见图1。

图1 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织HE染色病理表现(×100)

2.4大鼠结肠组织中IL-6、IL-10含量 模型组结肠组织中IL-6含量明显高于正常组和敛疮生肌组(P均<0.05),IL-10含量明显低于正常组和敛疮生肌组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织中IL-6、IL-10含量比较

2.5大鼠结肠组织中NF-κBp65蛋白阳性表达情况 正常组可见少量NF-κBp65蛋白阳性表达,光密度值为0.189±0.021;模型组NF-κBp65蛋白阳性表达较多, 光密度值为0.415±0.032,明显高于正常组(P<0.05);敛疮生肌组NF-κBp65蛋白阳性表达较模型组少,光密度值为0.313±0.029,明显低于模型组(P<0.05)。见图2。

图2 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织中NF-κBp65阳性表达情况(免疫组化,×100)

2.6大鼠结肠组织中ICAM-1 mRNA表达情况 正常组、模型组、敛疮生肌组结肠组织中ICAM-1 mRNA相对表达量分别为1.06±0.03,2.35±0.32,1.85±0.31,模型组明显高于正常组和敛疮生肌组(P均<0.05)。

3 讨 论

溃疡性结肠炎发病机制尚未完全明确,与遗传、肠黏膜屏障、肠道微生态、免疫应答等均有关,其中促炎细胞因子如IL-6上调、抗炎细胞因子如IL-10下调在溃疡性结肠炎黏膜损伤中发挥着重要作用[7]。NF-κB在溃疡性结肠炎的发病和进展中发挥着关键作用,其可诱导炎症介质的表达,其过度激活可导致大量促炎因子释放,释放的细胞因子又进一步活化NF-κB,使炎症不断放大[8]。ICAM-1是一种免疫调节因子,一般情况下肠黏膜中ICAM-1表达较低,当肠黏膜出现病变后,ICAM-1与炎性细胞因子互相作用可使炎症加重,形成恶性循环[9]。

溃疡性结肠炎归属于中医“久痢”“久泻”等范畴,病位在大肠,与脾、肝、肾、肺有密不可分的关系。湿热蕴结肠道,气血瘀阻为基本病机,脾虚为发病之本,饮食不调多为诱因。本病活动期以标实为主,缓解期多属本虚标实,主要为脾虚失健,正虚邪恋,也有兼肾亏者。《景岳全书》记载“脾肾虚弱之辈,但犯生冷极易作痢”“泄泻之本,多责之于脾肾”。活动期溃疡性结肠炎可以被理解为疮疡在肠道的一种表现,《医略》记载“以痢之赤白脓血,是痈疡之类”,《医学心悟》载“治痢之法必参合治痈之意”,故可称溃疡性结肠炎为“内痈”“内疡”。本研究中药灌肠方以敛疮生肌为治疗原则,方中青黛性寒,具有清热解毒、凉血消斑之功,《得配本草》记载“青黛,除郁火,解热毒,……止血痢”; 枯矾取其涩肠止泻之功,《神农本草经》称其具有“主寒热泄痢”之功,《本草纲目》记载“治诸血痛……疮疡,取其酸涩而收之性也”;赤石脂具有涩肠止泻、收敛止血、敛疮生肌之功;炉甘石有生肌敛疮、收湿止痒、解毒明目之功;血竭具有活血定痛、化瘀止血、敛疮生肌之功,《本草分经》记载其“甘咸平性急,入心肝血分,散瘀生新,和血敛疮”;全方药量精当,共奏敛疮生肌之功。现代药理研究显示,青黛可以降低IL-6、IL-10、IL-1等促炎因子的水平,具有调节肠道免疫反应及改善肠道菌群的功能[10];赤石脂具有抑制血小板聚集,吸附肠道有害物质,清洁肠道作用[11-12];煅炉甘石具有促进大鼠伤口成纤维细胞及毛细血管形成的作用,可加快肉芽组织增生,从而加快伤口愈合[13-14];血竭具有抗炎、镇痛、促进创面愈合和改善肠黏膜微循环等作用[15-16]。

本实验结果显示,敛疮生肌组DAI评分、结肠组织病理学评分及结肠组织中IL-6含量、NF-κBp65蛋白表达光密度值、ICAM-1 mRNA表达量均明显低于模型组,结肠组织中IL-10含量明显高于模型组。提示敛疮生肌灌肠疗法可能通过上调IL-10表达和下调IL-6、NF-κBp65、ICAM-1表达,从而减轻溃疡性结肠炎大鼠肠道免疫炎症反应,促进肠黏膜修复。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。