利用SSR 标记鉴定新疆地方葡萄品种资源亲缘关系

王 勇 孙 锋 李玉玲 苏来曼·艾则孜 伍国红 郭平峰

新疆是我国重要的葡萄种植区， 葡萄面积和产量均居全国首位， 同时拥有丰富的葡萄种质资源。 在葡萄生产中，主要通过枝蔓扦插、绿枝嫁接等无性繁殖方式繁育苗木， 一些小型育苗企业或果农根据自己的意愿随意命名， 导致“多品同名”或“同物异名”现象严重，给苗木市场经营和果农生产造成了很大影响， 甚至产生了一定的经济损失。 新疆葡萄瓜果研究所几十年来不断在全疆开展葡萄种质资源普查、 收集与保存工作， 目前已收集疆内大多数地方品种资源，现选择6 组地方品种资源利用SSR 标记对其亲缘关系进行鉴定， 为品种资源利用和新疆葡萄产业健康发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料 试验材料均来自新疆葡萄瓜果研究所葡萄种质资源圃， 为4 年生6 个新疆地方品种近似或疑似组合19 个品种， 详见表1。

表1 参试新疆地方品种资源

1.2 引物 引物为课题组前期以107 份葡萄种质资源为材料筛选出的15 对SSR 标记，详见表2。

表2 15 对葡萄基因组SSR 标记引物

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄基因组DNA 的提取 参照CTAB改良法提取葡萄试材基因组DNA； 通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的试材基因组DNA 的浓度和纯度； 将DNA 溶液分为两份， 1 份放入-20 ℃冰箱中长期保存， 1 份放入4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 反应体系 使用PCR 反应体系为2×Taq Mix 酶10 μL，SSR 双引物混合液（10 μmol/mL）0.8 μL，模板（20 ng/μL）2 μL，dd H2O 7.2 μL；总反应体系为20 μL，PTC-100 型PCR 仪上进行反应。扩增程序参照王勇等的方法，在操作中根据各引物差异进行体系优化。

1.3.3 PCR 产物的检测 利用2%琼脂糖凝胶对扩增的PCR 产物进行水平电泳检测，若有扩增结果不理想的， 需要进行补充， 然后由生物技术公司通过毛细管电泳检测产物片段种类和大小。

1.3.4 数据分析 利用Excel 软件处理数据，利用NTSYSpc 2.10 s 软件绘制遗传距离矩阵和亲缘关系树状图，进行亲缘关系分析。

2 结果与分析

2.1 参试品种组合的亲缘关系 如表3 所示，15 对SSR 标记在6 组新疆地方品种组中扩增的位点基因和等位基因的数量存在很大差异。扩增基因数在26～58 之间， 其中马奶子近似品种最多（58 个）， 无核白近似品种最少（26个）。

表3 15 对SSR 标记对6 组新疆地方品种扩增的位点基因和等位基因

6 组新疆地方品种组中， 每一组所有品种具有的相同基因比率在6.9%～100%之间。 其中，无核白近似品种和木纳格近似品种的最高，均为100%；马奶子近似品种的最低，为6.9%；其次为和田地方品种的，为8%。

扩增等位基因数在15～51 之间， 其中马奶子近似品种最多（51 个）， 无核白近似品种最少（15 个）。 6 组新疆地方品种组中的每一组合所有品种具有的相同基因比率在0%～100%之间。 其中， 无核白近似品种和木纳格近似品种的最高， 均为100%； 马奶子近似品种的最低，为0。 这说明6 个组每个组品种间的亲缘关系存在很大差异， 大小顺序为马奶子近似品种＞和田地方品种＞喀什喀尔疑似品种＞无核白鸡心疑似品种＞木纳格近似品种=无核白近似品种。

2.2 参试品种组合亲缘关系分析

2.2.1 无核白5 个近似品种亲缘关系分析 无核白、长穗无核白、长粒无核白、大粒无核白、香蕉王的遗传距离和相似系数如图1 所示。 5 个品种的遗传距离为0，相似系数为1，说明长穗无核白、长粒无核白、大粒无核白、香蕉王应为无核白营养系， 在15 个SSR 标记基因位点上不存在差异。

图1 无核白与4 个近似品种的遗传距离和相似系数

2.2.2 参试马奶子5 个近似品种亲缘关系分析马奶子、夏马奶、红马奶、紫马奶、里扎马特的遗传距离和相似系数如图2 所示。 就遗传距离而言，最近的是马奶子与夏马奶，为0.018 2，其次为红马奶与紫马奶，为0.668 9；最远的是里扎马特与紫马奶，为1.250 9，其次为红马奶与夏马奶，为1.029 6；其他品种间的值居于中间。 就相似系数而言， 相似度最高的是马奶子与夏马奶，为0.98，其次为马奶子与里扎马特，为0.538，相似度最低处为0.46，在此处将5 个品种分为两类：一类为马奶子、夏马奶、里扎马特，另一类为红马奶、紫马奶。 在相似系数0.538 处将里扎马特与马奶子、夏马奶分开；在相似系数0.564 处将红奶子与紫马奶分开。这说明，5 个品种中，马奶子与夏马奶存在较近的亲缘关系，与其他品种及其他品种间的亲缘关系较远， 为不同类型品种，可能因果实性状类似马奶而命名。

图2 马奶子与4 个近似品种的遗传距离和相似系数

2.2.3 参试和田地方品种亲缘关系分析 图3表明， 和田地区的3 个地方品种的遗传距离较远，相似系数较小。 其中和田红与和田绿、和田黄的遗传距离分别为0.916 3、1.252 6， 和田黄与和田绿的遗传距离为0.800 6。和田红与和田绿、和田黄的相似系数约为0.35，和田绿与和田黄的相似系数为0.46。 这说明3 个品种可能为不同类型品种。

图3 3 个和田地方品种的遗传距离和相似系数

2.2.4 参试木纳格近似品种亲缘关系分析 图4 表明， 绿木纳格与红木纳格的遗传距离为0，亲缘关系相似系数为1。 这说明两者可能为同一品种或其中一个为另一个的芽变类型。

图4 2 个木纳格近似品种的遗传距离和相似系数

2.2.5 参试无核白鸡心疑似品种亲缘关系分析图5 表明， 无核白鸡心与香妃无核白鸡心的遗传距离为0.557 7，亲缘关系相似系数为0.4。这说明两者的亲缘关系较远，不是同一品种。

图5 无核白鸡心与香妃无核白鸡心遗传距离和相似系数

2.2.6 参试喀什喀尔与花叶哈什哈尔亲缘关系分析 图6 表明，喀什喀尔与花叶哈什哈尔的遗传距离为0.821 0， 亲缘关系相似系数为0.28。这说明两者的亲缘关系较远，为不同品种。

图6 喀什喀尔与花叶哈什哈尔的遗传距离和相似系数

3 结论

利用15 对葡萄基因组SSR 标记引物对6组19 个新疆葡萄地方品种植株DNA 基因位点的基因型进行了测定与分析。 结果表明，6 个组合每个组合品种间的亲缘关系差异较大。其中，无核白近似组合和木纳格近似组合的亲缘关系最近，马奶子近似组合的亲缘关系最远，喀什喀尔近似组合次之。

在无核白近似组合中，5 个品种的亲缘关系相同， 可能为同一品种或无核白及无核白芽变。在马奶子近似组合中， 马奶子与夏马奶关系近似，其他品种间关系较远，认为是不同品种类型，可能因果实性状类似马奶而命名。 和田红、和田绿、和田黄3 个品种为不同品种。 绿木纳格和红木纳格可能为同一品种或其中一个为另一个的芽变类型。 无核白鸡心与香妃无核白鸡心为不同品种。 喀什喀尔与花叶哈什哈尔为不同类型。

本研究仅利用15 对SSR 标记对试验材料对应位点的基因型进行了分析， 可能存在局限性， 下一步需要通过植物学和果实性状进一步验证。