超高液相色谱-串联质谱法测定贝类组织中环境雄激素睾酮的前处理方法优化

付梅， 申春琴， 汪政希， 刘梅， 姚维志， 原居林， 彭希文， 吕红健

1. 西南大学 水产学院/淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室/农业农村部长江上游水生生物多样性保护研究中心，重庆 400715；2. 浙江省淡水水产研究所/农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室/浙江省鱼类健康与营养重点实验室，浙江 湖州 313001

环境雄激素作为一类典型的内分泌干扰物, 不仅会干扰生物体的内分泌系统导致其生长发育受阻, 同时还会影响微生物群落的结构与功能[1-2], 并对人体健康和生态安全造成威胁． 环境中的雄激素主要来源于动物的分泌物和激素药物的使用[1,3-4]． 研究发现, 环境雄激素主要通过城市污水处理厂、 畜禽养殖场、 造纸厂及水产养殖场等废水排放进入水环境, 可蓄积在水生生物体内, 并沿食物链进行传递, 进而对水域生态系统和人体健康造成危害[1,3-4]． 贝类作为水生食物网尤其是底栖食物网的重要组成部分之一, 对水域生态系统的物质循环和能量流动具有重要的作用[5-6]; 同时, 贝类因口味鲜美、 营养价值高, 深受消费者的喜爱． 睾酮(Testosterone), 又称睾丸素、 睾丸酮, 是生物体内含量最高、 最重要的雄激素, 也是一种主要的环境雄激素[1]． 开发一种测定贝类组织中睾酮质量浓度的前处理方法, 有助于贝类组织中类固醇激素的定量分析, 可为研究类固醇激素污染物在底栖食物网中的迁移转化与贝类水产品安全监管提供方法基础与技术支撑．

前处理方法中样品的提取与净化对水产品中类固醇激素测定的回收率、 稳定性等具有较大的影响． 陈秋华等[22]在筛查水产品16种激素残留的研究中发现, 提取剂和吸附剂的种类和使用量均会影响目标化合物的回收率． 通常用于提取动物组织中激素物质的溶剂有乙酸乙酯、 甲醇、 正己烷、 叔丁基甲醚、 二氯甲烷、 乙腈、 乙醚等及其混合溶液[23-26], 但由于目标激素和基质差异, 样品前处理提取剂的选择并无统一定论, 因此针对贝类中特定激素测定需进行提取剂的优化筛选． 样品经过提取和富集后, 常采用液相萃取除脂法[27-29]、 固相萃取柱净化法[24,30-31]、 净化剂净化法[17,22, 32]、 超低温冷冻离心除脂法[19,33-34]等去除样品基质中的脂肪、 蛋白质等杂质, 从而降低干扰, 提高方法的检出限, 并延长仪器的使用寿命[23]． 黄鸾玉等[19]认为, 除脂是水产品前处理必不可少的步骤, 且除脂方法以及固相萃取柱的选择都会影响净化效果． 李佩佩等[35]在测定水产品中甲基睾酮的残留时发现, 石油醚作为除脂溶剂, 易残留, 会对目标物造成严重干扰, 因此, 除脂净化方法直接影响贝类中雄激素的回收率． 冷冻离心除脂法因操作简便、 净化效果好、 待测激素损失较低[18,36], 常单独或与其他方法结合使用, 被广泛应用于各种基质中激素物质的净化． 本研究拟在超低温冷冻离心的基础上, 结合净化剂[37-38]和固相萃取柱[19], 探寻适用于贝类的高效率净化方法．

水产品中类固醇激素的检测研究对象多为鱼类和甲壳类, 贝类中的类固醇激素测定的研究鲜见报道[17, 39], 因此, 本研究拟以典型雄激素睾酮作为目标化合物, 利用超高液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS), 对贝类-河蚬(Corbiculafluminea)样品前处理方法中的提取和净化等条件进行优化, 以期得到较为理想的贝类雄激素测定前处理方法．

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

睾酮, 北京索莱宝科技有限公司; 睾酮-d3, SUPELCO公司, 纯度均大于98.0%． 甲醇、 丙酮、 乙酸乙酯、 乙腈、 正己烷、 二氯甲烷, Honeywell公司; 甲酸, CNW公司; 叔丁基甲醚, Alfa Aesar公司, 以上有机试剂均为色谱纯试剂． 中性氧化铝(FCP100-200目), 上海泸试实验室器材股份有限公司; 无水硫酸镁(99.95%), 无水硫酸钠(99.95%), 上海麦克林生化科技有限公司, 均为分析纯． N-丙基乙二胺(PSA), 杭州微米派科技有限公司; 高纯氮气, 重庆启迪气体有限公司; Poly-sery HLB(Hydrophilic and Lipophilic Balance)固相萃取柱, CNW公司．

1.2 标准曲线的配制

用乙腈将4.00 mg/L的睾酮标准储备溶液逐级稀释, 配制成0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 μg/mL的标准溶液, 混匀后测定, 以质量浓度为横坐标, 以色谱图峰面积为纵坐标绘制标准曲线．

1.3 样品前处理

1.3.1 样品的制备

实验所用河蚬购自重庆市开州区某养殖场, 剖取软体组织于离心管中, 组织捣碎机捣碎并充分匀浆, -20 ℃保存备用．

1.3.2 睾酮的提取

一个黑社会组织，之所以能够作恶近20年，得益于背后的“保护伞”——无为县法院刑事审判庭原副庭长吴业平。据周帮海供述，吴业平有“能量”。七年前，周帮海的马仔吴克任犯下两起寻衅滋事、两起故意伤害案件，他向吴业平送上2万元并请求轻判。在“吴庭长”的操纵下，身负四起情节严重案件的吴克任，仅被判处缓刑二年。连吴业平自己都说：“像这样的案子判缓刑，在法院还从来没有过。”

目标提取物睾酮为弱极性化合物, 本研究分别选用乙酸乙酯、 乙腈、 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)4种提取剂提取睾酮, 具体步骤如下:

准确称取(1.00±0.02) g匀浆试样于研钵中(3重样), 加入5 g预烘(110 ℃, 12 h)后的无水硫酸钠, 研磨至生物样品不粘在研钵上, 静置30 min后, 转移至50 mL离心管中, 并用5 mL提取剂润洗研钵和研磨杵, 全部转移至离心管中; 加入0.5 mL质量浓度为1 μg/mL的睾酮-d3, 混匀; 向离心管中再次加入提取剂5 mL; 涡旋振荡提取5 min后, 超声10 min; 再次涡旋振荡5 min后, 静置提取1 h; 于4 ℃ 5 000 r/min离心10 min后将上清液转移至新的50 mL离心管中; 残渣用5 mL提取剂重复提取2次, 合并上清液(共20 mL), 待净化．

针对不同提取剂进行回收率比较分析时, 统一采用超低温冷冻离心法净化样品．

1.3.3 净化

超低温冷冻离心: 将上清液于-80 ℃冷冻1 h; 解冻后, 于4 ℃ 10 000 r/min离心8 min; 准确移取5 mL上清液于玻璃试管中, 氮吹至近干, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)复溶后, 定容至1 mL; 过0.22 μm有机滤膜, UPLC-MS/MS测定．

超低温冷冻离心-净化剂: 将上清液于-80 ℃冷冻1 h; 解冻后, 于4 ℃ 10 000 r/min离心8 min; 准确移取10 mL上清液于已加入净化剂(0.5 g无水硫酸镁, 0.5 g中性氧化铝和0.2 g PSA)的离心管中, 涡旋混匀5 min, 以10 000 r/min离心5 min后准确移取5 mL上清液于玻璃试管中, 氮吹至近干, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)复溶后, 定容至1 mL; 过0.22 μm有机滤膜, UPLC-MS/MS测定．

超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱: 预先用3 mL甲醇和3 mL水先后缓慢通过HLB固相萃取柱使其充分活化; 将上清液于-80 ℃冷冻1 h; 解冻后, 于4 ℃ 10 000 r/min离心8 min; 准确移取5 mL上清液于玻璃试管中, 氮气吹干后加入3 mL甲醇溶解残渣, 并将其转至15 mL离心管中; 再用7 mL纯水润洗玻璃试管, 合并至离心管中, 混匀; 取甲醇溶液层以小于2 mL/min的流量通过预先活化的HLB固相萃取柱上样, 弃去滤液; 再用6 mL的20%甲醇溶液通过HLB固相萃取柱进行淋洗, 弃去流出液, 抽吸HLB固相萃取柱至近干; 用4 mL的90%甲醇溶液对HLB固相萃取柱进行洗脱, 收集洗脱液; 将洗脱液在50 ℃下氮气吹干后, 取乙腈和0.1%甲酸水溶液(9∶1)充分复溶, 定容至1 mL; 过0.22 μm有机滤膜, UPLC-MS/MS测定．

1.4 UPLC-MS/MS条件

采用Waters UPLC-Q-TOF-MS ACQUITY UPLC系统在灵敏模式下用正电喷雾(ESI+)离子源对睾酮定量． 色谱柱为ACQUITY BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm), 睾酮进样体积为1 μL, 恒定流速为0.4 mL/min; 流动相由0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)组成; 去溶剂化温度和离子源温度分别为400 ℃和120 ℃, 锥形和去溶剂化的流速分别为50 L/h和800 L/h; 毛细管电压和锥形电压分别为3 000 V和40 V, MS碰撞能量范围为20～40 eV(图1)．

图1 乙酸乙酯提取睾酮的多反应监测色谱图

1.5 数据处理

对实验所得数据用Microsoft Excel 2019进行处理．

2 结果与分析

2.1 提取剂的选择

本研究考察了乙酸乙酯、 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)、 乙腈4种提取剂对贝类-河蚬组织中睾酮的提取效果． 由表1可知, 乙酸乙酯作为提取剂回收率最高, 达101.6%, 叔丁基甲醚、 正己烷-二氯甲烷(1∶1)、 乙腈对睾酮的提取回收率相当, 在84.8%～89.4%之间． 4种提取剂中, 正己烷-二氯甲烷(1∶1)提取效率最低, 可能是正己烷提取油脂杂质较多, 不利于净化[40]． 使用乙腈作为提取剂时相对标准偏差为12.6%, 远大于其他3种提取剂, 表明乙腈作为提取剂稳定性不足, 可能是乙腈能致蛋白质变性, 易使样品结块, 从而导致回收率不稳定[41]． 综上所述, 4种提取剂中, 乙酸乙酯作为提取剂回收率高且稳定, 是河蚬组织中提取睾酮的最优选择．

表1 提取剂对睾酮回收率的影响

2.2 净化方法的选择

超低温冷冻离心、 超低温冷冻离心-净化剂、 超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱3种净化方法的净化效果见表2． 结果表明, 提取方法相同的情况下, 超低温冷冻离心法的回收率为89.4%, 高于超低温冷冻离心-净化剂法和超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱法． 超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱法回收率最低, 为77.4%, 原因可能是采用固相萃取柱进行萃取损失了部分目标化合物． 结果表明, 通过超低温冷冻离心法净化样品, 净化效果好、 回收率高、 操作简便, 可作为河蚬组织中睾酮提取后的净化方法．

表2 净化方法对睾酮回收率的影响

2.3 线性范围、 检出限和定量限

在选定的色谱/质谱条件下测定质量浓度分别为0.05, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00 μg/mL的睾酮标准溶液系列, 结果表明, 睾酮质量浓度在0.05～1.00 μg/mL内与色谱峰面积呈线性正相关, 其回归方程为y=390 214x-12 033,R2=0.998 9．

根据信噪比S/N≥3作为检出限,S/N≥10作为定量限, 计算得出河蚬组织中睾酮的检出限和定量限分别为6.25 ng/g和20 ng/g．

2.4 回收率和精密度

针对空白基质样品, 加标回收实验分别添加睾酮标准物质为低水平(20 μg/kg)、 中水平(40 μg/kg)、 高水平(200 μg/kg), 进行3次平行实验． 测定结果表明, 睾酮的平均回收率为66.4%～101.1%, 测定值的相对标准偏差在2.3%～11.6%之间(表3)． 随着加标量的增加回收率不断升高, 在国家标准GB/T 27404-2008规定的精密度范围内, 方法的准确度和精密度均符合实际分析检测的要求．

表3 河蚬中睾酮的加标回收率及精密度(n=3)

2.5 水产品中雄激素提取方法比较分析

因提取所用生物样品多为组织匀浆液, 含水率高, 基质水分残留对提取净化效果会产生较大影响[32]． 杨霄等[14]、 李凯华等[32]研究表明, 去除生物样品中的水分有利于提高目标化合物的回收率． 提取前加入无水硫酸钠[42-43]、 提取时加入无水硫酸钠[32]或无水硫酸镁[14]、 净化前过无水硫酸钠柱[8]等, 均可有效去除水分． 考虑操作简便性及提取液体积的量化问题, 本研究中采用预烘后的无水硫酸钠研磨匀浆后的样品, 静置至水分吸收完全后加入提取剂提取．

水产品中雄激素的提取常用的提取剂包括乙腈、 乙酸乙酯、 乙醚、 叔丁基甲醚、 甲醇、 正己烷、 乙腈-甲酸/乙酸混合液等[22, 24-25, 33]． 总体而言, 在超高液相色谱-串联质谱法测定水产品内睾酮的前处理中, 乙酸乙酯作为提取剂的提取效果较好(表4)． 杨帆等[16]、 邹红梅等[17]、 李向军等[24]研究均发现, 鱼类和甲壳类中睾酮的提取使用乙酸乙酯效果最佳, 回收率高、 稳定性好, 优于乙腈、 正己烷、 甲醇等, 与本文关于贝类中睾酮的提取研究结果一致． 此外, 邹红梅等[17]、 李向军等[24]研究还发现, 同时提取草鱼中甲基睾酮等多种激素时, 乙酸乙酯对大部分目标化合物的提取效率高于甲醇和乙腈． 关于黄鳝、 明虾等水产品中甲基睾酮、 群勃龙、 司坦唑醇等雄激素的提取研究亦表明, 乙酸乙酯作为提取剂的提取效率高, 且具有不易挥发、 毒性较小等优势[16, 27, 34,44]． 而陈秋华等[22]研究发现1%乙酸-乙腈作为提取剂提取大黄鱼、 南美白对虾、 梭子蟹中的雄激素时, 提取效果优于乙腈、 乙酸乙酯、 丙酮． 李凯华等[32]采用1%乙酸-乙腈提取草鱼中的雄激素, 能有效提取目标物． 综上, 乙酸乙酯和1%乙酸-乙腈对水生生物体中雄激素提取效果均较好, 但雄激素的回收率还与提取对象、 雄激素种类、 提取方法和净化方法等相关．

表4 水产品中睾酮检测的前处理方法比较

提取过程中, 可采取涡旋、 振荡、 超声等方法辅助提升提取效果[25]． 本文在对睾酮进行提取时采用涡旋振荡-超声-涡旋振荡的方式, 一方面超声能增加提取剂的穿透力从而进入细胞内部[23], 提取率高、 操作简便且样品处理量多[8]; 另一方面, 振荡可以加速被提取成分的扩散、 释放[25], 使得提取更加充分． 提取过程中, 重复提取可提高样品的回收率, 以重复1～2次为宜[17, 45-46]．

2.6 水产品中雄激素样品净化方法比较分析

样品净化方法中, 液相萃取除脂法, 常采用正己烷、 石油醚作为萃取剂． 然而黄鸾玉等[19]发现正己烷去脂的同时可一定程度溶解睾酮等类固醇激素, 故不可避免会造成目标化合物的损失, 且由于液相萃取过程中易发生乳化, 采用此法净化样品的回收率和精密度均不够理想[18, 28]．

固相萃取柱净化中常采用十八烷基键合硅胶吸附(C18)柱和HLB柱对水产品中的类固醇激素进行纯化． 已有研究表明, HLB固相萃取柱基质可耐受不同的溶剂, 使用时回收率不受柱床干涸的影响, 且吸附剂表面积较C18柱大, 除杂效果更好[19]． 靳凤龙[47]在研究动物源性食品中性激素的测定方法时发现, HLB固相萃取柱对性激素的回收率达89.7%～96.6%, 是C18柱的1.2倍． 李向军等[24]发现, 采用HLB固相萃取柱净化样品时, 可获得较高的回收率, 然而, 当处理对象为大黄鱼等高油脂样品时, 易发生乳化, 导致固相萃取柱堵塞． 本研究亦发现, 河蚬组织经提取后, 以超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱作为净化方法时的样品回收率低于其他方法, 表明净化过程中目标化合物有损失．

净化剂净化样品时, 常用的净化剂包括PSA、 中性氧化铝、 无水硫酸镁、 NaCl等． PSA作为吸附剂能清除许多基质成分, 但范小龙等[37]研究发现仅加入PSA, 目标激素的回收率未明显提高, 因此可加入其他净化剂共同净化样品． 无水硫酸镁在净化过程中可吸取多余的水分[37], 中性氧化铝具有良好的除脂能力[38], 二者与PSA共同净化样品可提高净化效果． 任雪冬等[38]在测定土壤中激素药物残留时发现以PSA、 中性氧化铝及无水硫酸镁为净化剂组合的样品基质干扰最小, 回收率最高．

超低温冷冻离心除脂法操作简便、 净化效果好、 待测激素损失较低[18], 已被广泛应用于各种基质中类固醇激素的净化． 孟霞等[34]研究发现, 黄鳝甲基睾酮的提取与净化中采用低温冷冻离心除脂, 样品回收率达88.1%～105.5%． 低温冷冻离心法常结合其他净化法对提取样品进行纯化． 黄鸾玉等[19]将冷冻离心结合HLB固相萃取柱净化罗非鱼样品, 甲基睾酮的回收率为73.6%～91.4%． 本研究中, 超低温冷冻离心净化后, 回收率最高, 高于超低温冷冻离心-净化剂和超低温冷冻离心-HLB固相萃取柱, 表明超低温冷冻离心净化效果好, 超低温冷冻后的净化剂净化和HLB固相萃取反而导致样品存在一定程度的损失． 田良良等[33]在测定鱼虾中丙酸睾酮残留量时亦发现, 仅采用超低温冷冻离心法净化样品, 丙酸睾酮的回收率为71.2%～104.5%, 而超低温冷冻离心与固相萃取柱相结合的方法并没有使杂峰减少, 与本研究结果相一致． 使用超低温冷冻离心法净化样品, 简化了前处理步骤, 简便易操作．

2.7 贝类中有机物的提取与净化

水产品中类固醇激素的检测研究对象多为鱼类和甲壳类, 贝类中雄激素测定的研究鲜见报道[17,39]． 不同于鱼、 虾中激素的检测主要针对肌肉中的激素, 贝类中激素检测多针对所有软体组织, 基质较复杂． 已有研究表明, 贝类组织中目标化合物提取的回收率变化范围大． 贝类中关于多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbon, PAHs)、 多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)等检测相关文献显示, 贝类空白基质加标回收率差异均较大[43,48-52]． 曹方方等[42]研究亦表明, 花蛤中的有机氯农药p, p’-二氯二苯二氯甲烷(p, p’-dichlorodiphenyl dichloroethane, p, p’-DDD)的回收率为62.3%～106.0%, 相对标准偏差为5.6%～21.0%, o, p’-二氯二苯三氯甲烷(o, p’-dichlorodiphenyl trichloroethane, o, p’-DDT)的回收率为73.8%～118.0%, 相对标准偏差为4.6%～16.0%．

本文采用乙酸乙酯作为提取剂, 超低温冷冻离心作为净化方法提取河蚬中的睾酮, 回收率为101.6%, 而空白基质加标回收率为66.4%～101.1%, 相对标准偏差为2.3%～11.6%, 变化范围略大, 我们推测可能贝类软体组织样品基质较复杂, 自身造成的影响难以避免．

3 结论

本研究优化了河蚬组织中睾酮质量浓度测定的前处理方法: 选取乙酸乙酯作为提取剂, 涡旋振荡超声提取, 并经超低温冷冻离心净化后利用超高液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)进行定量分析． 该方法简便、 快速, 且具有较高的准确度和精密度, 在20～200 μg/kg加标水平范围内, 回收率为66.4%～101.1%, 相对标准偏差为2.3%～11.6%, 适用于河蚬组织中睾酮的提取测定, 也可为其他动物组织中的环境雄激素残留分析提供参考．