2019～2022 年辽宁省规模场猪流感血清流行病学调查

魏园园，吴 浩，魏 澍，王 冰，邓文超，张皓淳，董 娜

（1. 辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110015；2. 沈阳市农业综合行政执法队，辽宁沈阳 110031）

自1918 年西班牙流感大流行至今已经过去了一个多世纪，但流感病毒对人类健康和动物生产的影响却有增无减。过去很长一段时间，研究者将精力主要放在了禽流感病毒，特别是高致病性禽流感病毒的研究和防控上。直到2009 年暴发了世界大流行的新甲型H1N1 流感病毒感染，而研究显示该病毒含有猪、禽及人流感病毒的基因片段，进化分析表明其与猪流感病毒（Swine influenza viruses，SIVs）密切相关，才使得人们对猪流感的流行情况愈发重视。猪流感病毒作为猪流感的病原可引起高度接触性的呼吸道传染病，不同日龄猪均可感染，具有发病率高、传播快等特点。患病猪的主要临床症状表现有食欲减退或废绝、精神沉郁、体温升高、呼吸困难、腹式呼吸和阵发性咳嗽等。

猪作为禽流感病毒和人流感病毒的共同易感宿主，被认为是流感病毒基因重排的“混合器”，长久以来在流感病毒的新毒株产生和适应性变异中承担着重要角色。因此，及时对猪流感感染和疫情情况进行监测对该病的防控和公共卫生安全都具有重大而深远的意义。为了解和掌握近年来辽宁省主要城市的规模化养猪场中猪流感病毒的存在情况，本试验利用血凝抑制试验对2019～2022 年采集的572 份猪血清样品进行了2009 年甲型H1N1（pdm/09 H1N1）、欧洲类禽型H1N1（EA H1N1）和经典H1N1（CS H1N1）猪流感病毒亚型的血清学检测，以期为掌握当地猪流感的发生及流行规律以及有效防控猪流感疫情提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料 2019 年3 月～2022 年6 月，在辽宁省沈阳、大连、本溪和铁岭4 个城市的规模化猪场随机选择没有咳嗽、打喷嚏和流鼻黏液等流感临床症状的健康猪，详细记录采集日期和采集地点以及每只猪的生长阶段。经前腔静脉采血，共获得猪血液样本572 份，低温转运。2009 年甲型H1N1（pdm/09 H1N1）、欧洲类禽型H1N1（EA H1N1）和经典H1N1（EA H1N1）猪流感灭活病毒作为标准抗原。采集健康公鸡（无禽流感和新城疫等抗体）的红细胞，制备成1%的鸡红细胞悬液。

1.2 主要试剂 PBS 溶液购自Life technologies 公司，胰酶、高碘酸钾、丙三醇和96 孔培养板均购自杭州普天生物技术有限公司。

1.3 猪血清样品的预处理 将采集的猪血液样本在室温下放置2 h 或4 ℃过夜，然后以3,000×g离心5 min 来收集血清样本，将所有分离的血清样品保存在-20 ℃用于后续检测。为了排除非特异性血凝抑制因素，正式开展试验前将所有血清样品均采用“胰酶- 加热- 高碘酸盐”的方法进行预处理。在300 μL 血清中添加150 μL 胰酶，置于56℃水浴中作用30 min，冷却至室温后立即加入900 μL高碘酸钾溶液，室温下作用15 min；然后，加入900 μL 丙三醇溶液，继续室温下作用15 min；最后将750 μL PBS 溶液添加到上述混合物中，混匀后置于4 ℃冰箱备用。

1.4 各亚型猪流感病毒4 单位抗原（4 HAU）的制备 首先参照赵玉仲的方法利用血凝试验测定各亚型猪流感病毒抗原的效价，然后根据血凝效价配制4 HAU 抗原，在开始血凝抑制试验检测血清样品之前必须对4 HAU 进行测试验证，且最好做到现用现配。

1.5 血凝抑制试验 将预先处理好的血清样品30 μL 与等量的4 HAU 在96 孔板中混合，于室温条件下孵育10～15 min；向每个孔中加入30 μL 1%的鸡红细胞悬液，在室温下作用15 min。血清样品如果有一个孔发生血凝抑制作用，此时血清的效价即为1：10，判定为阳性。

2 结果与分析

2.1 2019～2022 年不同年份辽宁省规模场猪流感抗体检测结果 2019 年3 月～2022 年6 月分别从辽宁省30 个不同的规模化猪场采集猪血清样本572份，利用血凝抑制试验进行抗体检测。结果如表1所示，在监测的时间段内，猪流感病毒的三个亚型pdm/09 H1N1、EA H1N1 和CS H1N1 均能在辽宁省规模化猪场的猪血清中检测到，抗体阳性血清总数为304 份，总血清阳性率达53.15%。而监测的30个规模化猪场中有27 个猪场检测出阳性样本，阳性猪场的比例占90%。2019～2022 年间，三种猪流感病毒亚型的抗体阳性率分别为14.16%、18.00%和20.98%，表明EA H1N1 和CS H1N1 两种亚型的猪流感阳性比例较高。除了2021 年度EA H1N1 亚型的阳性比例低于pdm/09 H1N1 亚型外，其余几个年份均是pdm/09 H1N1 亚型的阳性比例最低。上述试验结果表明，辽宁省规模化猪场中猪流感的感染较为普遍，且主要以EA H1N1 和H1N1 两种亚型为主。

表1 2019～2022 年不同年份辽宁省规模化猪场猪流感抗体检测结果

2.2 2019～2022 年辽宁省四个城市规模场猪流感抗体检测结果 如表2 所示，对2019～2022 年监测的辽宁省下属的四个不同城市的规模化猪场猪流感抗体检测结果分析可知，沈阳、大连、本溪和铁岭四个城市的猪场均存在不同程度的猪流感感染，其中沈阳猪场的抗体阳性率最高，达到72.09%，而其余三个城市猪场的抗体阳性率也都在40%以上。沈阳的猪场以EA H1N1 亚型猪流感为主，本溪和铁岭的猪场以CS H1N1 亚型为主，大连猪场则主要是pdm/09 H1N1 亚型。

表2 2019-2022 年辽宁省不同城市规模化猪场猪流感抗体检测结果

2.3 2019～2022 年辽宁省规模场不同生长阶段猪流感抗体检测结果 对该测时间段内不同生长阶段的猪流感抗体检测结果如表3 所示，分析认为，仔猪的猪流感血清阳性率最高，达到了78.65%，其次是保育猪的血清阳性率达到了58.97%，而育肥猪的阳性率最低，为37.61%。

表3 2019～2022 年辽宁省规模化猪场不同生长阶段猪猪流感抗体检测结果

3 讨论

猪流感病毒主要侵害猪的呼吸道上皮细胞，患病猪极易继发猪呼吸与繁殖障碍综合征和猪传染性胸膜肺炎等多种呼吸道疾病。猪流感在“禽- 猪-人”的种间传播链中扮演着重要角色，不仅给养殖业带来损失，而且对公共卫生造成危害。

我国于1991 年由郭元吉等人从猪群中第一次分离到猪流感病毒毒株，经鉴定属于经典H1N1 亚型。随后，不同亚型的猪流感毒株相继被分离得到。目前，在中国猪群中存在多种亚型的猪流感病毒，包括在北美持续存在了多年的经典H1N1，EA H1N1 和北美三重排等。pdm/09 H1N1 猪流感是2009 年4 月在墨西哥新出现的一种猪源性流感病毒，被发现之后迅速向全世界传播。本调查选择了pdm/09 H1N1、EA H1N1 和CS H1N1 这三种猪流感病毒亚型进行监测，根据血凝抑制试验的检测结果，2019～2022 年的辽宁省规模化猪场广泛存在猪流感病毒感染。我们对规模化猪场的监测以年度为单位，没有细化季节时间，从结果来看，2019～2022年猪场均检测出了阳性样本且不同年份之间的检测结果差异不明显，提示我们不同于人流感的明显的季节性特征，猪流感的季节性可能不明显。兰德松等对2012～2017 年辽宁省猪流感流行情况进行了血清学调查分析，结果显示，2012～2014 年猪群中的优势亚型为EA H1N1，2015～2017 年的优势亚型为pdm/09 H1N1。本试验的调查结果显示，2019～2022 年辽宁猪场中EA H1N1 和CS H1N1亚型在猪群中更占据优势。两者结果的差异可能与监测的地点和采样时间不同有一定关系。我们进一步对猪群的不同生长阶段进行划分，检测结果反映了辽宁省近年来不同生长阶段猪群中猪流感的感染情况，结果显示血清阳性率最高的是仔猪，这与的赵玉仲的研究结果一致。今后希望对猪流感病毒在猪群中的流行特征研究继续深入，这对合理制定猪流感防控措施将起到至关重要的作用。