猪伪狂犬病活疫苗（TP 株）冻干保护剂筛选和冻干工艺的优化

王洪峰，关 双，李 雪，房 良，夏 伟，梁与时，孟相秋，张 剑，田志军

（1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨 150069；2. 哈尔滨维科生物技术有限公司，黑龙江哈尔滨 150069；3. 东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；4. 吉林正业生物制品股份有限公司，吉林吉林 132011）

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的一种急性传染病，在猪群呈暴发流行，常引起妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、新生仔猪大量死亡，育肥猪发生严重的呼吸道症状和增重滞缓、种猪不育，给养猪业造成巨大的经济损失。

免疫接种是防制猪伪狂犬病的主要策略，猪伪狂犬病活疫苗（Bartha K61 株）是上世纪60 年代匈牙利科学家通过细胞传代培养获得的基因缺失弱毒株，在世界范围内得到了广泛应用和认可。但2011 年下半年以来，国内许多免疫过猪伪狂犬病活疫苗（Bartha K61 株）的规模化猪场出现了疑似猪伪狂犬病流行，本单位从14 个猪场采集样品，均分离到PRV 强毒。gE 基因序列分析显示最近流行的PRV 位于一个相对独立的分支中，与以前分离的毒株亲缘关系相对较远。猪伪狂犬病活疫苗Bartha K61 株免疫易感动物绵羊和仔猪，用新分离的PRV HeN1 株进行攻击，证实免疫Bartha K61 株疫苗不能提供对PRV HeN1 株攻击的完全保护。因此，我们认为猪伪狂犬病病毒发生变异，亟待研发新的疫苗。

我们将PRV HeN1 株在细胞上连续低温传代培养和药物筛选，获得了一株在Us 区缺失gI、gE、Us9、Us2 及部分反向重复序列、UL 区的TK 基因内部缺失716bp 的5 基因缺失病毒，命名为猪伪狂犬病病毒TP 株。动物试验表明猪伪狂犬病病毒TP 株具有良好的安全性，且对国内流行毒株的免疫保护效力优于Bartha K61 株，是一株优良的候选疫苗株。

为了使猪伪狂犬病活疫苗（TP 株）冻干制品物理性状良好，病毒损失小，我们进行了冻干保护剂优化和冻干工艺的研究，摸索出了适合于该疫苗规模化生产的冻干工艺。

1 材料

1.1 病毒液 猪伪狂犬病病毒TP 株病毒液，病毒含量为108.0 TCID50/mL，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所制备。

1.2 Vero E6 细胞 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应。

1.3 细胞培养液 完全培养液为含10%胎牛血清和青、链霉素各100 U（μg）/mL 的DMEM 液；细胞维持液为含青、链霉素各100 U（μg）/mL 的DMEM液；DMEM培养液及胎牛血清，均购自GIBCO 公司。

2 方法

2.1 冻干保护剂的筛选

2.1.1 保护剂的配制 按如下方法配制蔗糖明胶保护剂。

（1）不同浓度蔗糖保护剂的配制 在冻干保护剂中蔗糖的添加量分别为30%、35%、40%、45%和50%，明胶添加量均为8%。

（2）不同浓度明胶保护剂的配制 在冻干保护剂中明胶的添加量分别为6%、7%、8%、9%和10%，蔗糖添加量均为40%。

2.1.2 冻 干 将猪伪狂犬病病毒TP 株病毒液分别与不同的冻干保护剂均按照8∶1 的比例混合后，定量分装，2 mL/瓶，进行冷冻真空干燥。

2.1.3 检 验 （1）性 状 观察制品的颜色及状态，加入稀释液后的溶解状态。

（2）病毒含量测定 将不同保护剂冻干的病毒液分别用DMEM 培养液进行10 倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95 个稀释度，分别接种长成良好单层的Vero E6 细胞，每个稀释度接种8 孔，100 μL/孔，置37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养7 d。每天观察细胞病变，记录细胞病变（早期可见细胞膨大、圆缩，逐渐形成网状病灶）情况，按照Reed-Muench 法计算TCID50。

2.2 冻干比例的优化 将猪伪狂犬病病毒TP 株病毒液与含8%明胶、含40%蔗糖的蔗糖明胶保护剂分别按5∶1、6∶1、7∶1、8∶1 和9∶1 的比例混合后，定量分装，2 mL/瓶，进行冷冻真空干燥。冻干后制品按2.1.3 的方法进行性状检验及病毒含量测定。

2.3 冻干工艺的优化 将猪伪狂犬病病毒TP 株病毒液与含8%明胶、含40%蔗糖的蔗糖明胶保护剂按8∶1 的比例混合后，定量分装，2 mL/瓶，按如下方法进行冻干曲线的优化。冻干后制品均按2.1.3项进行检验。

2.3.1 预冻阶段预冻速度的优化 分别采用速冻法和慢冻法对制品进行预冻，其他冻干环节采用既有曲线，筛选最优的预冻方法。

2.3.2 预冻阶段冻结时间的优化 采用最佳预冻速度对制品进行冻干，设定冻结时间分别为1 h、2 h 和3 h，筛选最优的冻结时间。

2.3.3 升华阶段一期干燥温度的优化 一期干燥分别设定升华温度-10～10 ℃、5～10 ℃梯度、10℃进行冻干，筛选最优的干燥温度。

2.3.4 升华阶段一期干燥时间的优化 一期干燥分别设定升华时间8 h、11 h 和14 h 进行冻干，筛选最优的干燥时间。

2.3.5 产品加热最高许可温度及时间的优化 对产品加热的最高许可温度及时间进行考察，设立三个梯度，即25 ℃加热4 h、35 ℃加热3.5 h、40 ℃加热3 h，筛选产品加热最高许可温度及最优时间。

3 结果

3.1 冻干保护剂的筛选 分别对蔗糖明胶保护剂中蔗糖和明胶的添加量进行了优化。结果表明，蔗糖添加量为40%、明胶添加量为8%时，冻干的制品性状较好，病毒含量较高，详见表1 和表2。

表2 不同明胶浓度冻干后样品检验结果

3.2 冻干比例的优化 将病毒液与冻干保护剂按照不同比例混合后冻干，观察制品的外观，并测定病毒含量。结果表明，当病毒液与冻干保护剂按8：1 的比例冻干后，病毒含量较高，且性状较好，详见表3。

表3 冻干比例优化的试验结果

3.3 冻干工艺优化结果

3.3.1 预冻阶段预冻速度的优化 分别采用速冻法和慢冻法对制品进行预冻，结果表明，采用速冻法冻干后制品性状较好，病毒含量较高，详见表4。

表4 预冻速度优化试验结果

3.3.2 预冻阶段冻结时间的优化 设定冻结时间分别为1 h、2 h 和3 h，对制品进行冻干。结果表明，冻结时间2 h 和3 h，冻干制品的性状较好，病毒含量较高，详见表5。

表5 冻结时间优化的试验结果

3.3.3 升华阶段一期干燥温度的优化 一期干燥分别设定升华温度-10～10 ℃、5～10 ℃、10 ℃进行冻干。结果表明，升华温度为5～10 ℃，冻干后制品的性状较好，病毒含量较高，详见表6。

表6 一期干燥温度优化的试验结果

3.3.4 升华阶段一期干燥时间的优化 一期干燥分别设定升华时间8 h、11 h 和14 h 进行冻干。结果表明，升华时间11 h 和14 h，冻干后制品的性状较好，病毒含量较高，详见表7。

表7 干燥时间优化的试验结果

3.3.5 加热最高许可温度及时间的优化 对产品加热的最高许可温度及时间进行考察，设立三个梯度，即25 ℃加热4 h、35 ℃加热3.5 h、40 ℃加热3 h。结果表明，25 ℃加热4 h，冻干后制品的性状较好，病毒含量较高，详见表8。

表8 加热最高许可温度及时间优化的试验结果

4 讨论

明胶蔗糖保护剂是最为传统最为常见的保护剂，并且广泛应用于兽用生物制品，不但价格低廉，而且生物活性存活率高，保存期长。但蔗糖明胶保护剂的组分浓度、病毒液与保护剂配比对该冻干制品的物理性状、病毒含量存在一定影响。我们通过调整蔗糖明胶保护剂中蔗糖和明胶的比例、调整病毒液和冻干保护剂的添加比例，确定蔗糖添加量为40%、明胶添加量为8%配制的保护剂，病毒液与其按8：1 的比例冻干的制品性状较好，病毒含量较高。

分别采用速冻法和慢冻法对制品进行冻干，结果表明，速冻法冻干后样品性状较好，病毒含量较高，因此确定采用速冻法对样品进行冻干。对预冻时间、一期干燥第一步干燥温度、干燥时间、加热的最高许可温度及时间进行了优化，结果表明，预冻时间1 h、一期干燥第一步干燥温度为5～10 ℃、干燥时间为14 h、干燥温度25 ℃维持4 h，为最优的冻干曲线。尽管冻干工艺摸索还不够细致，数据还不尽详实，但对猪伪狂犬病活疫苗（TP 株）的生产具有重要指导意义。

在规模化生产中，可以在我们已优化的冻干曲线基础上对预冻时间、升华阶段（一期干燥）温度和时间、解析干燥（二期干燥）最高许可温度及时间进行微调，增加掺气段并对掺气真空度进行调整，能够降低干燥温度，缩短干燥时间，从而缩短疫苗冻干周期，提高工作效率，降低能源（水、电）消耗，降低生产成本。

5 结论

5.1 蔗糖明胶保护剂中蔗糖的添加量为40%、明胶添加量为8%。

5.2 病毒液与冻干保护剂的最佳比例为8∶1。

5.3 采用速冻法对样品进行冻干。

5.4 预冻时间 1h、一期干燥第一步干燥温度为5～10℃、干燥时间为14 h、干燥温度25 ℃维持4 h，为最优的冻干曲线。