枳实-白芍不同配伍比例及枳实生品与炮制品换用的枳实芍药散化学成分研究

余远盼，林桂梅，李医名

辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600

枳实芍药散由枳实和白芍两药配伍而成，始见于《金匮要略》“枳实（烧令黑，勿太过），芍药等分。上二味，杵为散，服方寸匕，日三服，并主痈脓，以麦粥下之”，用于“产后腹痛，烦满不得卧”。枳实性温，能破气消积、化痰除痞；芍药酸寒，养血敛阴、缓急止痛。两药合用，枳实得芍药行气不伤血，芍药得枳实养血不瘀滞，共奏行气和血止痛之功[1-2]。枳实始载于《神农本草经》，历代古籍记载有清炒、麸炒、土炒、面炒、炒炭、酒炙、醋炙、蜜炙、姜炙等多种炮制方法[3]。枳实药性峻烈，麸炒后能缓和苦燥之性，增强健脾和胃之功[4]。枳实芍药散中枳实为炒炭后入药，可入血分行血中之气滞。目前临床使用枳实为生品或麸炒品，偶有使用清炒品[5]。《本草蒙筌》有“不及则功效难求，太过则气味反失”，体现了不同炮制方法对药物化学成分的影响不同。药对作为临床处方用药中相对固定的配伍形式，在方剂配伍中起到相辅相成的作用，药对配伍比例为经方研究的关键问题之一。有研究发现，药对不同配伍比例对有效成分的溶出有很大影响[6-8]。研究药对配伍比例对成分提取率的影响具有十分重要的意义。因此，不同炮制品枳实及枳实与白芍不同配伍比例对枳实芍药散化学成分的影响值得探索。

本研究根据枳实芍药散临床实际使用情况，以其水煎液为研究对象，以辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、没食子酸、(+)-儿茶素、芍药苷和芍药内酯苷9个成分为指标，采用HPLC考察枳实-白芍药对不同配伍比例及枳实生品与炮制品换用对枳实芍药散化学成分提取率的影响，以期从化学成分变化角度为解析枳实炮制原理及经方配伍提供依据。

1 仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪（配置Waters e2695泵、Waters 2998检测器，Empower 3数字处理软件），沃特世公司；DFT-200型高速万能粉碎机，浙江温岭市林大机械有限公司；PTHW型电热套，上海棱标仪器有限公司；AS系列超声波清洗机，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；AE240型十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；FA1004B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

枳实饮片和白芍饮片分别购于江西省和安徽省，经辽宁中医药大学王荣祥教授鉴定，分别为芸香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果和毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，符合2020 年版《中华人民共和国药典》标准。麦麸（批号160801）购于安徽省。对照品辛弗林（批号110227-200306），中国药品生物制品检定所；芸香柚皮苷（批号S0808 AS）、柚皮苷（批号A0319AS）、橙皮苷（批号D1106AS），大连美仑生物技术有限公司；新橙皮苷（批号200029）、芍药内酯苷（批号102086），江苏永健医药科技有限公司；芍药苷（批号DSTDS007001）、没食子酸（批号DST190715-008）、(+)-儿茶素（批号DST190628-001），乐美天医药/德尔特生物公司。所用对照品纯度均不低于98%。甲醇、乙腈为色谱纯（美国TEDIA公司），其他试剂为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 清炒枳实

称取大小分等的枳实饮片100 g。将炒锅加热至约180 ℃，投入净枳实片，快速翻动，炒至枳实表面淡黄时，立即取出，摊开晾凉[9]。

2.1.2 麸炒枳实

取大小分等的枳实饮片100 g，麦麸10～15 g。将炒锅加热至约180 ℃，均匀撒入麦麸即刻烟起时，投入净枳实片，快速翻动，炒至枳实表面淡黄色、麦麸焦黑色时，立即取出，筛除炒制后的麦麸，摊开晾凉[10]。

2.1.3 炒炭枳实

取大小分等枳实饮片100 g，炒锅加热至约220 ℃，投入净枳实片，翻炒至枳实表面焦黑色、内部焦褐色，立即取出，摊开晾凉[9]。

2.2 供试品溶液制备

2.2.1 枳实生品和不同炮制品及白芍单煎液

分别精密称取枳实生品和不同炮制品及白芍粉末（过4号筛）各约0.2 g，置于圆底烧瓶中，精密加入纯净水25 mL，加热至沸腾后，保持微沸2 h，冷却后过滤，精密量取续滤液5 mL于10 mL量瓶中，用纯净水定容至刻度后混匀，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.2 枳实生品和不同炮制品与白芍合煎液

分别精密称取枳实生品和不同炮制品与白芍粉末（过4号筛）约0.2 g，按1∶1比例混合，置于圆底烧瓶中，精密加入纯净水25 mL，加热至沸腾后，保持微沸2 h，冷却后过滤，精密量取续滤液5 mL于10 mL量瓶中，用纯净水定容至刻度后混匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 对照品溶液制备

分别精密称取辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、没食子酸、(+)-儿茶素、芍药内酯苷和芍药苷对照品适量，加甲醇充分溶解并定容至刻度，制成浓度分别为0.307、1.313、1.036、0.508、0.486、0.484、0.503、0.486、0.515 mg/mL的对照品溶液。取各对照品溶液适量，制成混合对照品溶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 色谱条件

采用WondaSil C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～18%A；10～25 min，18%～20%A；25～30 min，20%～25%A；30～35 min，25%～30%A），柱温35 ℃，流速1 mL/min，检测波长230 nm，进样量10 μL。对照品及枳实生品和不同炮制品的枳实芍药散色谱图见图1。

图1 枳实生品和不同炮制品的枳实芍药散9个成分HPLC图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察

精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液适量，逐级稀释成不同浓度的系列对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定。以对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，9个成分线性关系考察结果见表1。各成分在相应浓度范围内的线性关系良好。

表1 9个成分线性关系考察结果

2.5.2 精密度试验

精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件连续进样6次，记录各成分峰面积并计算其RSD。结果显示，辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、没食子酸、(+)-儿茶素、芍药内酯苷和芍药苷的峰面积RSD 分别为0.90%、0.60%、0.66%、0.64%、0.80%、0.86%、0.63%、0.70%、0.65%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验

精密称取枳实生品和白芍粉末适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件，于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，计算各成分峰面积RSD。结果显示，辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、没食子酸、(+)-儿茶素、芍药内酯苷和芍药苷峰面积的RSD 分别为0.20%、0.27%、0.13%、1.87%、1.52%、0.44%、1.37%、0.43%、0.77%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验

精密称取6份枳实生品和白芍粉末适量，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件分别进样测定，记录各成分的峰面积并计算其RSD。结果显示，辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、没食子酸、(+)-儿茶素、芍药内酯苷和芍药苷峰面积的RSD分别为0.15%、1.03%、1.41%、1.85%、2.01%、0.61%、2.43%、0.60%、1.88%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 加样回收率试验

精密称取6份已知含量的生枳实和白芍混合粉末适量，分别精密加入适量各对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算平均回收率及其RSD。结果显示，辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、没食子酸、(+)-儿茶素、芍药内酯苷和芍药苷的平均加样回收率分别为97.96%、98.68%、99.24%、98.54%、98.46%、101.50%、97.24%、98.50%、99.27%，RSD分别为0.42%、0.83%、0.55%、1.11%、0.53%、0.51%、1.07%、0.52%、0.52%，表明该方法的准确度良好。

2.6 枳实-白芍不同配伍比例的枳实芍药散样品含量测定

分别精密称取枳实生品和白芍粉末（过4 号筛）适量，按“2.2.2”项下方法分别制备不同配伍比例（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）枳实-白芍合煎液，并按“2.4”项下色谱条件进样测定，记录各色谱峰面积，计算9个成分的含量，并计算提取率（该成分在总提取物中含量÷该成分所对应药材的取样量），结果见表2、图2。

表2 不同配伍比例枳实-白芍合煎液9个成分提取率比较（mg/g，n=3）

图2 不同配伍比例枳实-白芍合煎液9个成分提取率

由表2、图2可以看出，在不同配伍比例的枳实-白芍合煎液中，芸香柚皮苷、橙皮苷、没食子酸、(+)-儿茶素和芍药内酯苷的含量随枳实所占比例增加而升高，推测枳实在该药对中所占比例越大，越有助于上述5个成分溶出；当枳实-白芍配伍比例为2∶1、1∶1、1∶2时，辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷在水煎液中的提取率最高。

2.7 枳实生品与炮制品换用的枳实芍药散样品含量测定

分别取枳实生品和不同炮制品及白芍粉末适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定，记录各色谱峰面积，计算9个成分含量，结果枳实和白芍单煎液与枳实芍药散中9个成分含量有一定差异，见表3。

表3 枳实生品和不同炮制品与白芍配伍前后9个成分含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

枳实的主要活性成分包括生物碱和黄酮两大类，其中以柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷为代表的黄酮类成分具有抑制平滑肌收缩、改善功能性消化不良大鼠胃排空及抗炎、抗氧化等作用[11-13]，是枳实破气消积的主要活性物质，生物碱类代表成分辛弗林为《中华人民共和国药典》枳实的指标成分，因此，选取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及辛弗林含量为枳实的考察指标。白芍中以芍药苷为代表的单萜及其苷类具有保肝、镇痛、抗抑郁、抗肿瘤等作用[14-16]，而鞣质类成分也发挥着重要的药理作用，因此，选取芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸和(+)-儿茶素含量为白芍的考察指标。

本试验对供试品溶液进行全波长扫描，发现辛弗林、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及没食子酸在波长230 nm和283 nm处出峰均较好，芍药苷、芍药内酯苷、(+)-儿茶素在波长230 nm处出峰较好，因此检测波长确定为230 nm。同时比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2%乙酸水、甲醇-磷酸二氢钾溶液等流动相，发现甲醇-水溶液分离效率较低，而乙腈-水系统具有较好的色谱分离效果。为有效改善部分色谱峰的拖尾现象，加入磷酸以提高分离度。最终确定流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液。

枳实与白药配伍见于大柴胡汤、麻子仁丸、四逆散、排脓散等经典方剂，现行药品质量标准中以枳实-白芍配伍入药的中成药也较多，如2020年版《中华人民共和国药典》收载的脾胃舒丸（枳实∶白芍=1∶1）、香连化滞丸（枳实∶白芍=1∶2）、麻仁丸（枳实∶白芍=1∶1）、麻仁滋脾丸（枳实∶白芍=4∶3）等[17]。中药化学成分复杂，配伍应用时常发生助溶、沉淀等物理现象[18]，配伍后有些成分的结构、溶出率等也会发生变化，可能影响药物临床治疗效果。本研究建立了HPLC同时测定枳实芍药散9个成分含量的方法，发现其在单煎液和枳实-白芍不同配伍比例合煎液中的提取率有一定差异，表明枳实与白芍配伍后其化学成分含量发生变化。当配伍比例为2∶1、1∶1和1∶2时，辛弗林、柚皮苷、新橙皮苷3个主要药效成分在水煎液中的提取率高于其他配伍比例，表明合理的配伍比例有助于成分溶出，体现了经方配伍在方药运用中的重要性。枳实-白芍不同配伍比例对肝郁脾虚型肠易激综合征大鼠的药效学实验发现，当枳实-白芍比例为1∶1和2∶1时，其抗抑郁、镇痛、调节胃肠道功能作用较好，体现了古方配伍（1∶1）用药的合理性[19-21]。

本研究发现，白芍与枳实配伍后化学成分发生变化：组方与单味药白芍相比，芍药内酯苷、没食子酸、(+)-儿茶素的含量增加；生品及不同炮制品之间比较，清炒枳实芍药散中芍药苷和(+)-儿茶素的含量高于其他样品，而芍药内酯苷和没食子酸的含量在炒炭枳实芍药散中最高。

对比枳实生品和不同炮制品与白芍配伍前后黄酮苷类成分含量发现，单味药和复方中枳实经清炒和麸炒后柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量增加，而炒炭后黄酮苷类成分均降低。黄酮苷类成分作为枳实增强胃肠功能的主要活性物质，麸炒可提高黄酮苷类成分含量，保证其健脾消积作用，推测可能是麦麸在炒制过程中通过吸附等形式，将辅料中的成分传递至炮制品，还能吸收饮片中的部分挥发性成分，达到增强疗效、缓和燥性的作用；清炒也有助于黄酮类成分的溶出，可能是炒制过程破坏了细胞壁结构，促进了成分的溶出，但长时间加热可能会破坏其结构，故炒制过程中应该控制好温度和时间。枳实与白芍配伍后枳实中黄酮苷类成分含量降低而白芍中芍药内酯苷、没食子酸、(+)-儿茶素含量增加，表明与白芍配伍对白芍有效成分的溶出有促进作用，有利于增强白芍缓急止痛作用，结合枳实、白芍的性味特点发现，两者药性大致相反，配伍后能够相反相成。同时，枳实主要活性物质辛弗林经清炒和麸炒后含量有所增加，但炒炭后含量大幅降低，推测为长时间高温加热破坏其结构所致。另外，没食子酸含量在炒炭枳实芍药散中最高，可能是炒制过程中某些成分发生了分解或某些物质的转化使其含量增加，这与古籍中用于治疗妇女产后气滞、气结血凝等烦满不得卧相符，也证实了枳实芍药散中枳实炒炭的合理性。

本研究从炮制与经方配伍角度，比较枳实生品与炮制品换用的枳实芍药散化学成分变化，诠释古籍中运用炮制品的合理性。今后将从入血成分及其代谢情况入手开展研究，以期从体内物质代谢角度揭示枳实炮制原理。