多轮次筛选选育高酚酸耐受性丁醇生产菌

经玉洁，黄小倩，田璐毅，丁欢欢，卜 京，施超越，李汉广

多轮次筛选选育高酚酸耐受性丁醇生产菌

经玉洁，黄小倩，田璐毅，丁欢欢，卜 京，施超越，李汉广※

（江西农业大学生物科学与工程学院/应用微生物研究所，南昌 330045）

纤维原料预处理过程中会产生酚酸等抑制菌株生长的物质，为选育出高丁醇产量及高耐受酚酸胁迫丁醇生产菌株，该研究利用多因子复合筛选策略筛选出一株能够合成足够还原力与对丁醇耐受性较好的菌株W6。通过丁醇胁迫适应性进化获得丁醇耐受菌W6-1，其丁醇和总溶剂产量相较于菌株W6分别提高了14.01%和16.85%。通过紫外诱变处理菌株W6-1并结合理性筛选模型最终获得丁醇产量较高菌株W6-2，其丁醇及总溶剂产量分别可达到（9.51±0.06）和（15.32±0.11）g/L。最后将菌株W6-2通过酚酸胁迫适应性进化得到突变菌W6-3，其能耐受1.0 g/L酚酸胁迫环境，且丁醇和总溶剂产量相较于菌株W6-2分别提高了18.17%和17.49%。当以葛渣水解液为底物进行丙酮丁醇发酵时，突变菌W6-3的丁醇产量达（8.54±0.31）g/L，相较于菌株W6-2提高了26.71%。经多轮次诱变及适应性进化处理获得的突变菌的酚酸耐受性及发酵性能均有较大提高，该文所采用的多轮次筛选方法可以为其他快速筛选优良生产菌提供可靠的理论参考。

菌株；发酵；复合筛选；酚酸胁迫；水解液

0 引 言

化石能源作为当今世界的主要能源之一，在给人类经济发展带来无限动力的同时，也产生了如大气污染、温室效应等诸多环境问题[1]。为克服这一不利局面，人们开始着手开发可持续绿色能源，在诸多绿色能源中，生物丁醇作为一种多功能四碳醇（C4H10O），与其他传统生物燃料（低级醇）相比具有弱腐蚀性、低挥发性、强混合性及可在现有管道中进行运输等优点，被认为是最具潜力的第二代新型生物燃料[2-3]，因此，加强对丙酮丁醇发酵的研究具有重要的现实意义。

传统的丙酮丁醇发酵（acetone-butanol-ethanol，ABE）是以淀粉、葡萄糖为底物进行，原料成本往往占生产成本的60%～70%[4]，寻找廉价易得可发酵原料逐渐成为ABE发酵研究的热点[5]。木质纤维素是地球上最丰富的可再生原料，近年以其作为ABE发酵原料成为该领域研究的焦点[6]，中国有很多地方种植葛根，年产量在500万t以上，从葛根中提取葛根异黄酮和葛根粉后，产生的副产物为葛渣[7]，成分为75%的纤维素和半纤维素、矿物离子、少量含氮化合物，由于粗纤维含量高，大多数生物难以直接利用，导致其除少数用来造纸或用作饲料外，其余大部分被废弃[8]，这一行为会造成资源的大量浪费，给后续环境处理带来不少的压力。因此，将葛渣用作ABE发酵原料，不仅可以解决制药或食品企业的废弃物排放问题，还可生产生物燃料。然而现有的常用丁醇生产菌（、等）不能将木质纤维素直接利用，需要一个复杂的预处理过程[9]。尽管在生物质预处理[10]、酶解[11]和抑制物脱毒[12]等方面均进行了较多的工艺改进，但在水解过程中还是会产生大量抑制微生物生长与代谢的物质，如呋喃类（糠醛和5-羟甲基糠醛（5-HMF））、酚类（如丁香酸、4-羟基苯甲酸和对香豆酸）以及弱酸类（如乙酸和甲酸）等[12-13]。其中酚类化合物由于会破坏生物膜，导致细胞膜完整性的丧失，减弱了细胞膜作为选择性屏障的能力，因此酚类化合物被认为是抑制作用最强的一大类化合物[14-16]。要想高效利用木质纤维水解液作为ABE发酵原料，必须有效消除酚类化合物对细胞生长带来的不利影响[17]。

在木质纤维水解液的酚类化合物中，酚酸的种类和含量都要比酚醛多，且其化学性质稳定，一般的物理方法和化学方法都难以将其消除[18-20]。而且脱毒过程往往存在可发酵糖的损失以及增加纤维原料的操作成本等问题，若能获得高酚酸耐受性菌株，有望用未脱毒纤维水解液进行ABE发酵。为选育出高酚酸与高丁醇耐受性丁醇生产菌株，本研究利用丁醇-刃天青-可溶性淀粉多因子复合筛选策略筛选出一株具有较强丁醇合成能力的菌株；利用丁醇胁迫适应性进化及紫外诱变技术复合处理菌株以提高其丁醇产量及丁醇耐受性，然后将菌株进行酚酸胁迫适应性进化，以提高菌株的酚酸耐受性能，并以葛渣水解液为底物评估突变菌株对木质纤维素水解液利用能力的变化。本研究结果可为高效利用木质纤维水解液为碳源的丁醇生产菌株的选育及其发酵提供一定的理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 发酵菌株

本实验室保藏的菌株W（W），为本实验室从江西滕王阁药业有限公司周边村庄的土壤中筛选所得[21]。

1.2 培养基

1）分离纯化培养基：葡萄糖40.0 g/L，可溶性淀粉40.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，胰蛋白胨6.0 g/L，乙酸胺3.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，琼脂20.0 g/L，pH值为6.0，121 ℃灭菌20 min。

2）筛选培养基：在分离纯化培养基基础上添加8.0 g/L丁醇及0.02 g/L刃天青。

3）发酵培养基：葡萄糖55.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，CaCO34.0 g/L，pH值为6.0，121 ℃灭菌20 min。无机盐溶液（MgSO4·7H2O 0.02 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L，NaCl 0.01 g/L）及维生素（对氨基甲苯酸0.001 g/L、维生素B1 0.001 g/L、生物素0.000 01 g/L）配制成的母液用0.22 µm的微孔滤膜进行过滤除菌后加入。

1.3 多因子复合筛选和胁迫适应性进化

1.3.1 多因子复合筛选

菌株接种至丁醇-刃天青-可溶性淀粉多因子筛选固体平板，通过判断褪色圈、菌落大小以及ABE发酵后溶剂产量，筛选出一株能够合成足够还原力和对丁醇耐受性较好的菌株。

1.3.2 丁醇胁迫适应性进化

丁醇的浸泡浓度预设定为10、15、20和25 g/L，具体步骤如下：取0.1 mL对数生长期的细胞转接至含10 g/L丁醇的发酵培养基和未加丁醇的发酵培养基中（对照），试验组出现明显生长现象后取对数期细胞液涂布至对应丁醇浓度的筛选培养基中，培养并挑取生长健壮、透明圈最大的菌株到含15 g/L丁醇固体平板进行适应性进化。如此逐步提高培养基中的丁醇浓度，最终获得高丁醇耐受性菌株，本研究所有试验均进行生物学重复。

1.3.3 酚酸胁迫适应性进化

适应性进化所用的复合酚酸为丁香酸、对羟基苯甲酸和对香豆酸，等比例配成0.5、0.75、1.0、1.1、1.2和1.3 g/L溶液。将活化的菌株按10%的接种量接入含有0.5 g/L混合酚酸的发酵培养基培养7～10 d，然后取菌液涂布到含有0.75 g/L混合酚酸的固体培养基培养，挑选长势较好的菌株接种到含有0.75 g/L复合酚酸的液体培养基发酵培养，如此逐步提高混合酚酸培养基浓度进行转接和培养，最终获得高酚酸耐受性菌株。

1.4 紫外诱变处理

取700 μL培养24 h的发酵液在试管中采用10倍稀释法进行稀释，利用无菌生理盐水将其梯度稀释至10-4，在紫外灯下分别照射0、0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9和10 min，每个处理三个平行。诱变完成后在黑暗环境下取100 μL进行涂布，避光放置在37℃培养箱中培养，计算其致死率和正突变率（丁醇产量高于原始菌株5%以上的视为正突变菌株），确定紫外诱变最佳时间。两者的计算公式如下：

式中F为致死率（fatality rate，FR），%；为正突变率，%；1为诱变前菌落数；2为诱变后菌落数；3为诱变后正突变菌落数。

1.5 葛渣水解液制备

将葛渣和蒸馏水按1∶8（质量体积比）的比例混合，加入适量浓H2SO4使其终浓度为1.0%（体积分数），搅拌混匀后于121 ℃高温高压下水解60 min，冷却后用Ca(OH)2粉末将pH值调整至6.0左右，然后通过离心收集上清从而获得葛渣水解液。

1.6 水解液丁醇发酵

将活化的菌株按10%的接种量接入水解液培养基（还原糖60.0 g/L，其他成分同发酵培养基）中，37 ℃静置培养，定期取样测定溶剂浓度等数据。

1.7 测定方法

1.7.1 还原糖测定

还原糖浓度利用DNS法[22]进行测定，测定波长为560 nm。

1.7.2 溶剂含量测定

通过内标法（内标为异丁醇）测定上清液中的溶剂含量[23]，气相色谱条件如下：气相色谱仪用的检测器与色谱柱分别为火焰离子检测器（FID）和毛细管柱（RB-5，30 mm×0.32 mm×0.25 mm），柱温、检测器和进样器温度分别为70、210和200 ℃，进样量1.0 μL。总溶剂为乙醇、丙酮和丁醇产量之和。

式中为产率，%；为得率，%；B为丁醇占比（Butanol ratio，B），%；：溶剂浓度，g/L；为发酵时间，h；C为还原糖消耗量，g/L；C：丁醇浓度，g/L；C：总溶剂浓度，g/L。

2 结果与分析

2.1 多因子复合筛选结果

ABE发酵分为产酸期和产溶剂期2个阶段[24]，在产酸期向产溶剂期过渡过程中，需要还原力NADH的参与[25]。NADH是碳代谢的重要辅因子，通过激活或抑制代谢途径中关键酶的活性对碳代谢流流向及其通量进行调控，因此高活力丁醇生产菌株往往具有较强的还原力合成能力[26]。刃天青作为常用的氧化还原指示剂，颜色变化灵敏，可鉴别细胞的还原能力，靳孝庆等[27]根据这一特点，设计了刃天青筛选平板，筛选出高还原活性的菌株。

本研究利用多因子筛选方案共分离纯化出58个单菌落，其中有6个单菌落颜色为白色至米黄色，呈近似圆形、菌落饱满、边缘向外扩散，表面呈不透明但有光泽，而且具有较大的透明圈和褪色圈，表明这6株菌具有较强的还原力，同时具有一定的丁醇耐受性。将此6个突变菌株分别命名为W1、W2、W3、W4、W5、W6，并将其以葡萄糖作为底物进行ABE发酵。

由表1可以看出，6株突变菌的丁醇产量在6.92～7.49 g/L之间，总溶剂产量均超过9.0 g/L，丁醇占总溶剂比例的平均值约为70%。其中菌株W2、W5和W6的丁醇产量为7.49、7.48和7.47 g/L，在此处理中丁醇产量相对较高，但W6丁醇占比高于W2和W5水平，因此采用菌株W6进行下一步的选育。

表1 筛选菌株在以葡萄糖为碳源条件下的溶剂产量

2.2 丁醇胁迫适应性进化

有研究表明提高生产菌的丁醇耐受性可以降低菌株的产芽孢率以保证发酵正常进行[28]。而通过外源添加溶剂（丁醇）的方式来模拟生物进化是提高菌株耐受性的一种操作简单、定向性强的技术。为进一步提高菌株W6的丁醇耐受性，本试验对菌株W6进行多轮次丁醇胁迫适应性进化，由表2可知，随着丁醇浓度的增大，菌株的丁醇和总溶剂产量逐渐提高，当外源添加20.0 g/L丁醇时，此时丁醇和总溶剂产量达到最大值，分别为（8.22±0.21）和（11.72±0.26）g/L，相较于对照组分别提高了14.01%和16.85%。当处理浓度超过20.0 g/L时，菌株溶剂产量反而略有下降，根据这一试验现象，将适应性进化浓度固定在20.0 g/L，此时获得的菌株命名为W6-1。

2.3 紫外诱变

紫外诱变作为一种传统的诱变手段，在提高微生物的生长或发酵方面起到过非常重要的作用[29]。该方法操作简单、成本低，普通的实验室均可开展，为了使适应性进化后的菌株W6-1获得一些新的优良性状以期进一步提高菌株溶剂产量，本研究将其进行紫外照射处理，结果如图1所示。

表2 不同浓度丁醇处理后的溶剂产量比较

由图1可知，菌株的致死率随着诱变时间的增加而上升，当处理时间为3 min时，菌株致死率达到78.05%；当处理时间为5 min时，菌株致死率为92.68%；处理时间超过7 min后，菌株的致死率可达100%。另一方面，诱变后菌株正突变率随着诱变时间的延长呈先升高后下降的趋势，当处理时间为3 min时，获得了最大正突变率（4.5%）。有研究表明菌体的诱变效果和生存能力在致死率为80%左右时为最佳诱变条件[30]，由此本试验确立最佳紫外诱变时间为3 min。

图1 不同诱变时间下菌株致死率及正突变率

将紫外诱变处理3 min后的菌悬液涂布于筛选平板，挑取褪色圈较大、健壮单菌落进行发酵试验。由图2可知，发酵结束后丁醇浓度在8.0 g/L以上的菌株约占57%，其中溶剂产量在菌株W6-1之上的有10株，占总菌株的38.46%。此外第13株菌的丁醇和总溶剂产量最大，分别为（9.51±0.06）和（15.32±0.11）g/L，相较于菌株W6-1分别提高了15.69%和30.72%（与菌株W6相比分别提高了27.31%和45.90%）。因此选第13株菌作为研究对象（命名为W6-2）。

图2 紫外诱变高产菌株丁醇和总溶剂产量

2.4 菌株W6-2遗传稳定性试验

为验证菌株W6-2的遗传稳定性，将菌株进行了10次传代培养，由表3可知，试验过程中菌株的丁醇和总溶剂产量稳定维持在8.56～9.12和12.02～13.81 g/L范围，10代丁醇与总溶剂的平均产量分别为8.75和12.62 g/L，与第1代相比分别仅降低了0.11%和1.94%，虽然10代丁醇及总溶剂产量略有所变化，但总体稳定，说明菌株发酵性能并无明显变化，由此可看出该诱变后获得的菌株具有很好的遗传稳定性。

2.5 酚酸胁迫适应性进化策略对菌株耐受性的影响

木质纤维素水解液中酚酸多以复合酚酸形式存在，为提高菌株W6-2对木质水解液中酚酸的耐受性，本研究选择了3种典型酚酸：丁香酸、对香豆酸和对羟基苯甲酸作为胁迫抑制剂。在进行酚酸胁迫适应性进化前，为了确定合适的胁迫浓度，研究了3种典型酚酸单一添加（0.25、0.5、0.75和1.0 g/L）对菌株W6-2发酵的影响，其结果如图3所示。

表3 菌株W6-2遗传稳定性试验

注：实线为丁醇产量，虎线为还原糖浓度。

试验结果表明，当丁香酸和对香豆酸添加量为0.25 g/L时，丁醇产量与对照组相比分别提高了19.77%和26.51%；当二者的添加量为0.5 g/L时，丁醇最终产量与对照组相比基本保持不变，而当二者的添加浓度为0.75 g/L时，菌株合成丁醇的能力开始受到明显抑制作用。另一方面，当对羟基苯甲酸添加量为0.5 g/L时，溶剂产量就开始受到明显抑制；当添加浓度为0.75 g/L时，在发酵结束时几乎无丁醇产生。

在单一添加的基础上探究了复合添加对菌株W6-2发酵的影响，以总酚酸浓度为0.5 g/L，丁香酸:对羟基苯甲酸、丁香酸:对香豆酸和对香豆酸:对羟基苯甲酸质量比为2:1、1:1与1:2和3种酚酸等比例加入发酵培养基培养，其结果如图4所示。从图4可知，3种酚酸等比例复合时抑制效果最强，发酵结束时其丁醇和总溶剂产量分别为（5.83±0.18）和（8.27 ± 0.36）g/L，相比对照组分别降低了32.56%和34.93%。当单一丁香酸和对香豆酸添加量为0.5 g/L时，丁醇产量分别为（8.34±0.69）和（8.53±0.71）g/L，等比例添加3种酚酸相较于单独添加丁醇产量抑制效果分别增强了43.05%和46.31%。相较于单独添加对羟基苯甲酸，等比例添加三种酚酸丁醇产量也略微下降。试验结果表明，单一的抑制物对菌株的生长抑制作用在低浓度时往往低于多种抑制物协同作用的；此外，3种酚酸混合添加比其中任意2种酚酸不同比例混合抑制效果更为明显。因此为将菌株W6-2在类似环境中进行胁迫驯化，选择了0.5 g/L的复合酚酸。

为进一步提高菌株W6-2对酚酸的耐受性能，本试验将其逐级置于不同比例复合酚酸的环境中进行胁迫适应性进化后获得一株高耐受酚酸胁迫突变菌株W6-3，将其置于0.5 g/L的胁迫环境，通过比较两者的生长情况来验证其对酚酸胁迫的适应能力。从图5可看出，在0～12 h内，两菌株生物量增长趋势基本相似，在12～24 h范围，菌株W6-2增长速率减缓，当培养至72 h，菌株W6-2的OD600为（0.80±0.06）。适应性进化后的菌株W6-3在12～24 h阶段处于对数生长期，之后增加速度才开始减缓，到培养结束时其OD600值为（1.21±0.10），相较于菌株W6-2提高了50.00%。

注：SA：丁香酸；PHBA：对羟基苯甲酸；PCA：对香豆酸，数值为其前面两种酸质量比，1∶1∶1为三种酸质量比。

图5 酚酸适应性进化前后菌株生物量变化趋势

为进一步考察突变菌株W6-3的发酵性能，将其与驯化前菌株W6-2分别置于含0、0.25、0.75和1 g/L的等比例复合酚酸的发酵培养基中，其结果如图6所示。

由图6可看出，突变菌株W6-3发酵结束后丁醇和总溶剂产量分别为（10.21 ± 0.11）和（14.44 ± 0.21）g/L，相较于菌株W6-2分别提高了18.17%和17.49%。当酚酸胁迫浓度处在较低浓度范围时（0.25 g/L），能产生低剂量兴奋效应[31]，此时能大大促进菌株W6-2的溶剂合成，产生这种现象的主要原因可能是低浓度抑制物可以促进NADH的合成，进而为丁醇等溶剂合成提供更多的还原力，而还原力的有效供给是提高丁醇产量的重要保障之一，这一现象与EZEJI[32]的研究结果一致。而高酚酸耐受菌W6-3对此浓度酚酸应激效果不明显，溶剂产量变化不大。当酚酸胁迫浓度达到0.5 g/L时，突变菌株W6-3丁醇产量相较于菌株W6-2提高了12.11%。当酚酸胁迫浓度达到1.0 g/L时，菌株W6-2基本停止发酵，而突变菌株W6-3总溶剂产量可达（3.42±0.42）g/L。由此可知，经过酚酸胁迫适应性进化后的突变菌株W6-3的酚酸耐受性有较大程度的提升，当其处在高浓度的酚酸胁迫环境中，仍能保持一定的生长及产溶剂能力。

注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。

2.6 葛渣水解液发酵产丁醇

本实验室前期研究了利用葛渣进行ABE发酵的可能性[21]，发现葛渣经过适当预处理可以作为ABE发酵原料，当以葛渣水解液为原料，以ART44为生产菌进行ABE发酵时，丁醇产量和产率分别达到（6.66±0.28）g/L和0.08 g/(L·h)，而且在研究葛渣水解液成分时发现总酚含量达到（0.79±0.06）g/L，已达到对菌株产生胁迫的浓度。为了解菌株W6-2和突变菌株W6-3利用木质纤维水解液为底物进行ABE发酵情况，将其置于葛渣水解液发酵培养基进行培养，其结果如图7所示。从图7可知，发酵结束后菌株W6-3的丁醇和总溶剂产量为（8.54±0.31）和（10.11±0.65）g/L，相较于W6-2分别提高了26.71%和18.00%；此外，W6-3的丁醇得率达到了0.17 g/g还原糖，与W6-2（0.14 g/g还原糖）相比提高了21.43%。因此，突变菌株增强了其对木质纤维素酸水解液的利用能力。

图7 菌株W6-2和突变菌株W6-3在以葛渣水解液为底物时的发酵特性比较

3 结 论

为了获得一株高耐受酚酸抑制物的丁醇生产菌株，本研究利用多因子复合筛选平板、丁醇胁迫适应性进化、紫外诱变处理以及酚酸胁迫适应性进化手段对出发菌株W进行选育，得出以下结论：

1）通过判断菌株在多因子复合筛选平板中透明圈和褪色圈大小，以及ABE发酵性能，筛选出一株具有较强还原力及丁醇耐受性的菌株W6。为进一步提高菌株W6的丁醇耐受能力，对其进行多轮次丁醇胁迫适应性进化，最终获得高丁醇耐受菌株W6-1，其丁醇和总溶剂产量分别为（8.22±0.21）和（11.72±0.26）g/L，与对照组相比分别提高了14.01%和16.85%。

2）为提高菌株溶剂产量，本研究对丁醇胁迫适应性进化后的菌株W6-1进行紫外诱变处理，最终获得突变菌W6-2，经发酵培养后其丁醇及总溶剂产量分别（9.51±0.06）和（15.32±0.11）g/L，相较于菌株W6-1分别提高了15.69%和30.72%；遗传稳定性试验结果表明菌株W6-2具有较好的遗传稳定性。

3）通过0.5 g/L复合酚酸对菌株W6-2进行胁迫适应性进化，得到了高酚酸耐受菌株W6-3，突变菌株W6-3的丁醇产量相较于W6-2提高了12.11%。当以葛渣水解液为底物进行发酵，其丁醇产量相较于W6-2提高了26.71%。

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Screening of butanol producing strain with high phenolic acid tolerance by the approach of multi-repeating stress acclimation

JING Yujie, HUANG Xiaoqian, TIAN Luyi, DING Huanhuan, BU Jing, SHI Chaoyue, LI Hanguang※

(,,330045,)

Carbon-neutral fuels (such as ethanol and butanol) have gradually drawn much attention in recent years, due to the ever-increasing perception of global warming and environmental protection. Among them, butanol can be expected to serve as one of the promising candidates for biofuels, such as less corrosive, higher octane number, lower solubility in water, and higher energy content, compared with ethanol. However, the high feedstock cost and low productivity can be still a challenge in the acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation, due to the product's (especially butanol) resistance or toxicity to the current butanol-producing strains. The overall economics of bio-butanol production can be enhanced using the abundant source, and low-price of materials (such as lignocellulose). Nevertheless, it must be appropriately pretreated, when these materials are used as the feedstock for the ABE fermentation. Various compounds can be formed during pretreatment. Moreover, the phenolic acids that are derived from lignin degradation can be the most toxicity inhibitor for the butanol-producing strains. In this study, some excellent strains were screened for the high tolerant phenolic acids stress and high butanol production. A multi-factor screening strategy was carried out to obtain the strain W6, in order to synthesize the sufficient reducing power and high tolerance to butanol. Furthermore, the strain W6 was then domesticated to further enhance the butanol tolerance via the appropriate concentration of butanol stress. As such, strain W6-1 was obtained, where the butanol and total solvent production were (8.22 ± 0.21) and (11.72 ± 0.26) g/L, respectively, which were 14.01% and 16.85% higher than that of strain W6. After that, strain W6-1 was treated to improve the production of butanol using UV mutagenesis combined with the multi-factor screening model. The high butanol production strain W6-2 was then selected after treatment. The butanol and total solvent production reached (9.51 ± 0.06) and (15.32 ± 0.11) g/L, resulting in an increase of 15.69% and 30.72%, respectively, compared with the strain W6-1. Finally, the high phenolic acid-tolerant strain W6-3 was achieved by the adaptive evolution strategy with phenolic acid stress condition. At the end of fermentation, the biomass increased by 50.00%, whereas, the butanol and solvent production of the mutant strain W6-3 increased by 18.17% and 17.49%, respectively, compared with the strain W6-2. When strain W6-3 was in the 0.5 g/L of phenol acid stress environment, the butanol production were 12.11% higher than that of strain W6-2, respectively. Once the phenolic acid stress concentration reached 1.0 g/L, there was no growth in the pre-domestication strain W6-2. However, the total solvent production of (3.42 ± 0.42) g/L was obtained for the mutant strain W6-3, indicating excellent phenol acid tolerance. Taking the puerariae slag hydrolysate as the fermentation feedstock, the production of butanol was (8.54 ± 0.31) g/L in the mutant strains W6-3, which was 26.71% higher than that of the strain W6-2. The phenolic acid tolerance and fermentation performance of the mutant strain were greatly improved after multiple rounds of mutagenesis and adaptive evolution. This finding can provide a reliable theoretical reference to rapidly screen the excellent producing trains, in order to fully meet the requirements of fermentation performance.

strains; fermentation; compound screening; phenolic acid stress; hydrolysate

2022-09-28

2023-03-09

国家自然科学基金项目（21466014）；江西省自然科学基金项目（20202BABL203042）；江西省研究生创新专项资金项目（YC2021-S350，YC2022-S433）

经玉洁，研究方向为生物质能源。Email：1962699928@qq.com

李汉广，博士，副教授，研究方向为微生物资源开发利用。Email：hanguangli@jxau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.202209241

S21; TQ923

A

1002-6819(2023)-07-0236-08

经玉洁，黄小倩，田璐毅，等. 多轮次筛选选育高酚酸耐受性丁醇生产菌[J]. 农业工程学报，2023，39(7)：236-243. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202209241 http://www.tcsae.org

JING Yujie, HUANG Xiaoqian, TIAN Luyi, et al. Screening of butanol producing strain with high phenolic acid tolerance by the approach of multi-repeating stress acclimation[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2023, 39(7): 236-243. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.202209241 http://www.tcsae.org